Waktu dan Lokasi Penelitian Alkaloid Depkes RI, 1995

28 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

e. Identifikasi Saponin Depkes RI, 1995

Sebanyak 100 mg ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 1ml etanol 70 kemudian ditambahkan 10ml air panas dan didinginkan. Kemudian dikocok vertikal selama 10 detik dan didiamkan selama 10 menit. Terbentuk buih setinggi 1 cm. Pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang.

f. Identifikasi Steroid dan Triterpenoid Fransworth, 1996

Sebanyak 100 mg ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 1ml etanol 70 kemudian ditambahkan pereaksi Lieberman-Buchard, adanya steroid menunjukan warna biru-kehijauan sedangkan triterpenoid menunjukkan warna merah, merah muda, atau ungu.

3.4.3 Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik

1. Parameter Spesifik Depkes RI, 2000

a. Identitas Meliputi deskripsi tata nama nama ekstrak, nama latin tumbuhan, bagian tumbuhan yang digunakan, nama tumbuhan Indonesia dan dapat mempunyai senyawa identitas. Tujuannya untuk memberikan identitas objektif dari nama dan spesifik dari senyawa identitas. b. Organoleptik Meliputi penggunaan panca indra untuk mendeskripsikan bentuk padat, serbuk-kering, kental, cair, dll, warna kuning, coklat, dll, bau aromatic, tidak berbau, dll, rasa pahit, manis, kelat, dll. Dengan tujuan untuk pengenalan awal yang sederhana.

2. Parameter Non Spesifik Ekstrak Farmakope Herbal, 2009; Depkes

RI,2000 a. Parameter Kadar Air Pengukuran kandungan air yang berada didalam bahan, dilakukan dengan cara yang tepat diantara cara titrasi, destilasi atau gravimetrik. Cara kerja menggunakan gravimetri yaitu masukan 1,5 gram ekstrak dan ditimbang saksama dalam wadah yang telah ditara. Keringkan pada suhu 105 o C selama 5 jam dan ditimbang. Lanjutkan pengeringan dan timbang setelah 1 jam sampai perbedaan selisih antara dua penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25. 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Kadar air = � � � � − � � � ℎ� � � � � 100 b. Kadar abu Bahan dipanaskan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap, sehingga menyisakan unsur mineral dan anorganik. Ditimbang 2 gram ekstrak dengan seksama ke dalam krus yang telah ditara, dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, diinginkan dan ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, aduk, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan kertas saring beserta sisa penyaringan dalam krus yang sama. Masukan filtrat ke dalam krus, uapkan dan pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu total dihitung terhadap berat bahan uji. Kadar Abu Total = � � � � � � �� 100

3.4.4 Penyiapan Hewan Uji

Tikus jantan galur Sprague-Dawley diaklimatisasi di Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Jakarta selama 1 minggu. Diberikan makan dan minum ad libitum. Ekstrak etanol 70 daun pacing Costus spiralis diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari selama 48 hari dengan dosis seperti tertera pada tabel rancangan percobaan Tabel 3.1. Dosis yang tertera merupakan hasil konversi dosis 25,50, dan 75 mgkgBB pada mencit ke tikus Adnan, 2000. 1. Kelompok I diberikan suspensi Natrium CMC 0,5. 2. Kelompok II ekstrak etanol 70 daun pacing 12,5mgkgBB yang disuspensikan ke dalam Natrium CMC 0,5. 3. Kelompok III ekstrak etanol 70 daun pacing 25mgkgBB yang disuspensikan ke Natrium CMC 0,5. 4. Kelompok IV ekstrak etanol 70 daun pacing 37,5mgkgBB yang disuspensikan ke dalam Natrium CMC 0,5.

3.4.5 Pembuatan Preparat

Setelah 48 hari, masing-masing hewan coba dikorbankan untuk diambil organ testisnya. Tikus dibius dengan eter, kemudian dibedah. Diambil bagian 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kauda epididimis dan dihitung jumlah spermatozoa kemudian bagian testis diambil untuk ditimbang dan dibuat preparat. Untuk mendapatkan sperma di dalam sekresi epididimis dilakukan dengan cara sebagai berikut: kauda epididimis diambil dan diletakkan ke dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9. Kemudian epididimis di plurut dalam wadah yang berisi NaCl fisiologis 0,9 tersebut disebut sebagai larutan stok yang digunakan untuk mengetahui kualitas dan kuantitas spermatozoa. Suspensi sperma dari epididimis yang telah diperoleh dapat digunakan untuk pengamatan konsentrsi spermatozoa Hartini, 2011. Untuk jaringan testis yang telah diambil, difiksasi dalam larutan Bouin dan dibiarkan selama kurang lebih 24 jam. Kemudian dilakukan pencucian, yaitu mencuci organ dengan alkohol 70 yang dilakukan berulang-ulang selama kurang lebih 30 menit. Hal ini bertujuan agar warna kuning larutan Bouin berkurang atau tampak jernih. Jaringan didehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol 70, 80, 96 dan alkohol absolut selama kurang lebih 1 jam untuk menarik molekul air yang keluar dari jaringan. Selanjutnya, jaringan dijernihkan dengan larutan benzil benzoat selama 24 jam, lalu dalam benzil sebanyak 2 kali 15 menit sampai jaringan tampak jernih atau transparan Ilyas, 2007. Setelah itu, dilakukan infiltrasi dengan parafin dalam beberapa tahap, yaitu jaringan direndam dalam parafin I selama 30 menit, parafin II selama 60 menit, dan parafin III selama 90 menit. Infiltrasi dilakukan dalam oven dengan suhu 56 o C-58 o C. Perlakuan berikutnya adalah penanaman jaringan dalam parafin cair lalu diletakkan dalam kotak kertas sesuai dengan ukuran masing-masing jaringan yang akan ditanam. Kotak kertas yang telah berisi jaringan dimasukkan dalam lemari es dan dibiarkan membeku Kusmana, 2001. Selanjutnya, pemotongan jaringan setebal 3-6µm dengan menggunakan pisau mikrotom putar dan hasil irisam ditempelkan pada kaca objek. Preparat pada kaca objek dipanaskan sampai jaringan mengembang dengan sempurna. Sebelum jaringan diwarnai, sediaan direndam dalam xilol selama 5 menit sebanyak 2 kali. Hal tersebut bertujuan agar sisa parafin yang masih merekat pada jaringan dapat dihilangkan. Xilol dihilangkan dengan merendam jaringan pada larutan alkohol bertingkat dari konsentrasi tinggi turun secara bertahap 100, 90, 80, dan 31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 70 masing-masing selama 3 menit. Untuk perwarnaan dilakukan dengan hematoksilin dan eosin HE. Jaringan yang telah diwarnai dijernihkan dengan xilol selama 5 menit agar jaringan tampak lebih cerah. Pada tahap akhir, jaringan testis pada kaca objek diberi entelan dan ditutup dengan kaca penutup sehingga dapat dilakukan pengamatan.

3.4.6 Pengukuran Parameter

1. Perhitungan konsentrasi spermatozoa

Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spematozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakan dalam cawan penguap yang berisi cairan NaCl sebanyak 500µ l. Spermatozoa dimasukkan ke dalam kamar Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubaurer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 3.2 Ilyas, 2007. Tabel 3.2. Pengenceran yang Dilakukan dan Kotak yang Dihitung No Jumlah Spermatozoa dalam 1 kotak Faktor Pengenceran Kotak Kecil yang Dihitung 1. 40 50 kali 5 2. 15-40 20 kali 10 3. ≤15 10 kali 25 Dari jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung Ilyas, 2007. Tabel 3.3. Cara Pengenceran No Pengenceran Pembuatan Pengenceran 1. 50 kali a. 980µL larutan George + 20µL spermatozoa b. 2.450µL Larutan George + 50µL spermatozoa 2. 20 kali 950µL larutan George + 50µL spermatoza 3. 10 kali a. 900 µL larutan George + 100µL spermatozoa b. 450 µL larutan George + 50µL spermatozoa Setelah pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran