d. KLT ekstrak kacang hijau
Pelat KLT dan 5 mgmL ekstrak kacang hijau dalam etanol disiapkan untuk ditotolkan sebanyak 75;100;150 µg dengan menggunakan mikropipet,
dielusi dengan fase gerak kloroform:metanol 7:3 vv, pelat tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dibuat 2 kali replikasi sebagai acuan
dan sebagai pelat uji bioautografi. e.
Bioautografi Pelat KLT hasil elusi yang telah kering, metode kontak dilakukan dengan
media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading, metode kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut
diangkat Inkubasi selama 18 jam, hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut.
10. Triturasi
a. Preparasi sampel triturasi
Ekstrak kacang hijau ditimbang 5 g, dicampurkan dan dihomogenkan dengan 5 g sea sand yang telah dibersihkan, ditambahkan sedikit metanol, dan
didiamkan selama satu malam. b.
Triturasi dengan pelarut n-heksana Hasil campuran sea sand dengan ekstrak kacang hijau kemudian
ditambahkan n-heksana 5 mL, divorteks, disentrifugasi, pelarut kemudian diambil dan disaring. Penambahan n-heksana pada solut campuran sea sand
dan ekstrak, divorteks, disentrifugasi, bagian pelarut diambil dan disaring, diulangi 2 - 5 kali hingga pelarut menjadi bening. Pelarut tersebut kemudian
dipekatkan sebagai hasil triturasi n-heksana. Campuran sea sand dan ekstrak kemudian dikeringkan dari n-heksana pada suhu ruang selama 1 jam.
c. Triturasi dengan pelarut kloroform : metanol 7:3 vv
Campuran sea sand dan ekstrak yang telah kering kemudian ditambahkan 5 mL kloroform : metanol 7:3 vv, divorteks, disentrifugasi, pelarut kemudian
diambil dan disaring. Penambahan n-heksana pada solut campuran sea sand dan ekstrak, divorteks, disentrifugasi, bagian pelarut diambil dan disaring,
diulangi 2-5 kali hingga pelarut menjadi bening. Pelarut tersebut kemudian dipekatkan sebagai hasil triturasi kloroform : metanol 7:3 vv. Campuran sea
sand dan ekstrak kemudian disimpan.
d. Uji Kromatografi lapis tipis KLT hasil triturasi
Ekstrak, hasil triturasi n-heksana, dan hasil triturasi kloroform: metanol 7:3 vv disiapkan dalam kadar 5mgmL dalam etanol. Kemudian ditotolkan
dalam pelat KLT masing-masing, dengan jarak elusi 5 cm dengan fase gerak kloroform : metanol 7:3 vv. Profil KLT dari ketiga kromatogram tersebut
diamati dan dideteksi dengan lampu UV 254 nm, 366 nm dan dilakukan pengarangan dengan reagen semprot asam sulfat 5 vv.
11. Kromatografi kolom
a. Preparasi sampel untuk uji kromatografi lapis tipis
Hasil triturasi n-heksana ditimbang 2,5 mg dilarutkan dalam 0,5 mL n- heksana.
b. Uji kromatogri lapis tipis KLT untuk optimasi fase gerak kolom
Hasil preparasi sampel ditotolkan pada pelat KLT, sejumlah 4 totol. Disiapkan 4 fase gerak yaitu: n-heksana : kloroform 50:50 vv, n-heksana :
kloroform 25:75 vv, kloroform, dan kloroform : metanol 98:2 vv,
kemudian pelat KLT tersebut dielusi dengan fase gerak tersebut dan diamati.
c. Preparasi sampel untuk kolom kromatografi
Hasil triturasi n-heksana sebanyak 300 mg ditimbang dan dicampurkan
dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan perbandingan 1:1.
d. Preparasi kolom kromatografi
Kapas yang akan digunakan dibilas dahulu dengan n-heksana. Kolom kromatografi disiapkan dengan susunan dari bawah yaitu, kapas, silika gel 60
untuk kolom kromatografi sekitar 3 cm, sampel yang telah dicampur dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi sekitar 0,5 cm, silika gel 60 untuk
kolom kromatografi 1 cm, dan ditutup dengan kapas.
e. Kromatografi kolom gradien
Kolom kromatografi yang telah disiapkan, akan dialirkan beberapa fase gerak dengan urutan sebagai berikut ini, yaitu, n-heksana : kloroform 50:50
vv, 40:60 vv, 30:70 vv, 20:80 vv, 10:90 vv, kloroform 100, kloroform : metanol 98:2 vv, 96:4 vv, 94:6 vv, 92:8 vv, 90:10 vv,
masing-masing disiapkan 5 mL dan tiap 2 mL hasil gradien kolom kromatografi ditampung.
f. Kromatografi lapis tipis KLT untuk konfirmasi hasil kromatografi
kolom gradien Setiap 2 mL hasil kolom kromatografi dikumpulkan, KLT dilakukan dan
diamati profil KLT nya. Profil KLT hasil kolom kromatografi yang sama disatukan, kemudian dipekatkan dan dihitung rendemen hasil.
g. Penyimpanan isolat
Isolat hasil pemekatan dilarutkan mengguanakan pelarut yang sesuai dengan konsentrasi 1 mg100 µL, kemudian dipekatkan dan disimpan dalam
freezer .
12. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas isolat senyawa
