9. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak kacang hijau
a. Pembuatan media TSB cair
Tiga g media TSB 30gL dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut
diautoclave. b.
Pembuatan media agar Tiga g media TSB 30gL ditambahkan 1,2 agar dilarutkan dalam 100
mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave.
c. Pembuatan larutan Mc-Farland 0,5 1,6 x 10
8
CFU Larutan Barium klorida 1,175 bv 0,05 mL ditambahkan dengan 9,95
mL larutan 1 bv asam sulfat Schwalbe, Moore, Goodwin, 2007. d.
Pembuatan saline water 0,9 bv NaCl 0,9 g ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL aquadest.
e. Preparasi bakteri uji
Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli atau S.aureus. Kultur bakteri induk dari media miring diambil 1 ose dan dikulturkan pada media TSB cair,
diinkubasi selama 18 jam. f.
Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli atau S.aureus, deret larutan
standard Mc Farland disiapkan. Sebanyak 2 tabung dibuat, masing-masing diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya menggunakan
larutan standar Mc Farland 0,5 konsentrasi mikroba 1,6 x 10
8
CFUmL dengan penambahan bakteri uji.
g. Penyimpanan kultur bakteri
Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, 0,5 mL diambil dan dimasukkan dalam microtube. Gliserol 5 vv ditambahkan dari 0,5 mL
kultur bakteri yaitu 25 x 10
-3
mL pada masing-masing microtube, dihomogenkan, diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator bersuhu 37°C.
disimpan dalam frezzer. h.
Pembuatan kontrol kontaminasi media Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara
pour plate , dibiarkan memadat, diinkubasi selama 18 jam dan dibandingkan
dengan perlakuan. i.
Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan
memadat. 100 µL bakteri diinokulasikan secara spreading. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
j. Pembuatan kontrol positif
Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. Sebanyak 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading.
Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL aquadest, diambil sebanyak 75;100;150 µg masing-masing dimasukkan dalam paper disk dalam
media agar yang telah diinokulasikan bakteri tersebut. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
d. KLT ekstrak kacang hijau
Pelat KLT dan 5 mgmL ekstrak kacang hijau dalam etanol disiapkan untuk ditotolkan sebanyak 75;100;150 µg dengan menggunakan mikropipet,
dielusi dengan fase gerak kloroform:metanol 7:3 vv, pelat tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dibuat 2 kali replikasi sebagai acuan
dan sebagai pelat uji bioautografi. e.
Bioautografi Pelat KLT hasil elusi yang telah kering, metode kontak dilakukan dengan
media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading, metode kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut
diangkat Inkubasi selama 18 jam, hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut.
10. Triturasi
Kategori