Jenis dan Rancangan Penelitian Hasil Determinasi Sampel Hasil Pengumpulan dan Penyiapan Bahan

22

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif .

B. Bahan dan Materi Penelitian

1. Bahan penelitian

a. Bahan utama berupa kacang hijau Vigna radiata L. R. Wilczek yang berasal dari PT. SUPER INDO, dengan batch number: 8-993408-010226. b. Bahan kimia yang digunakan meliputi DPPH pro analitik dan β-karoten pro analitik yang diperoleh dari Sigma Chem. Co., USA. Etanol, n-heksana, kloroform, metanol, asam sulfat, barium klorida, NaCl pro analitik yang diperoleh dari Merck, Germany. Akuades yang diperoleh dari Brataco Chemica. Reagen Dragendorff, AlCl 3 , FeCl 3 , sitroborat, vanilin sulfat diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma. Silika gel 60 F 254 for thin layer chromatography dan silika gel 60 0,040-0,063 mm for column chromatography dari Merck, Germany. Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang berasal dari. Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta. Amoksisilin diperoleh dari PT. Indofarma. Media agar yang digunakan trypticasein soy broth TSB dari Agarindo Biological Company , Agar No.1 diperoleh dari Oxoid.

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa micro haematocrit tubes , light meter Lutron, lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm, sentrifuge, vortex junke kunkel, mikropipet 10- 1000 μL; 1-10 mL Socorex, neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary evaporator Buchi, blender, kertas saring, tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki, frezzer, Autoclave YX-400Z, oven WTB binder.

C. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi sampel

Determinasi biji kacang hijau dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Determinasi sampel ini memastikan bahwa sampel yang digunakan untuk penelitian benar-benar kacang hijau Vigna radiata L. R. Wilczek.

2. Pengumpulan dan penyiapan bahan

a. Pengumpulan bahan Kacang hijau yang digunakan diperoleh dari PT. SUPER INDO. Bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji kacang hijau. b. Sortasi basah Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, kerikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan ranting dan bunga, bagian dari tanaman lain tangkai, daun, bunga dan biji inang, bahan yang rusak dan lain-lain. c. Pencucian Biji kacang hijau dicuci dengan cara menggunakan air mengalir sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada biji kacang hijau. Pencucian ini dilakukan sebanyak 3 kali. d. Pengeringan Biji kacang hijau yang masih basah dikeringanginkan dengan cara pengeringan adalah bahan dihamparkan di atas tampah secara merata dan ditutup dengan kain hitam yang diberi sedikit ruang sirkulasi udara dibawah sinar matahari. Akhir pengeringan ditandai dengan warna kacang hijau menjadi lebih gelap dari sebelum dijemur. e. Sortasi kering Biji kacang hijau yang sudah kering dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, kerikil, bahan yang rusak dan lain-lain. f. Penyerbukan Biji kacang hijau dibuat menjadi serbuk dengan menggunakan blender. g. Pengepakan dan penyimpanan Serbuk biji kacang hijau kemudian dibungkus dengan menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan ditambahkan silika gel penyerap lembab pada wadah penyimpanan serbuk simplisia. h. Susut pengeringan simplisia kacang hijau Bobot tetap dilakukan terhadap cawan petri yang akan digunakan, oven disiapkan dengan suhu 105°C, selama 60 menit. Setelah didapatkan bobot tetap petri, ditimbang 1 g serbuk simplisia kacang hijau dan direplikasi 3 kali. Cawan berisi serbuk simplisia kacang hijau tersebut kemudian dipanaskan dalam oven dengan suhu 105°C hingga diperoleh bobot tetap. i. Penyiapan simplisia kulit dan keping biji kacang hijau Kacang hijau yang digunakan diperoleh dari PT. SUPER INDO. Tahap penyiapan simplisia dilakukan sama dengan tahap pembuatan simplisia pada biji kacang hijau, yang dibedakan adalah adanya tahap pemisahan antara kulit kacang dengan keping biji kacang hijau. Kemudian kulit dan keping biji kacang hijau tersebut dilakukan pengeringan, sortasi basah, penyerbukan, penyimpanan dan pengepakan seperti tahap pembuatan simplisia kacang hijau.

3. Ektraksi

a. Ekstraksi kacang hijau Biji kacang hijau yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 1,0 kg dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah pelarut pertama, yaitu etanol 90 vv sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan menguapkan dengan rotary evaporator, diuapkan hingga menjadi ekstrak kental. b. Ektraksi kulit dan keping biji kacang hijau Simplisia kulit dan keping biji kacang hijau yang telah diserbuk ditimbang masing-masing 100 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah yaitu etanol 90 vv sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan menguapkan dengan rotary evaporator, diuapkan hingga menjadi ekstrak kental. c. Susut pengeringan ekstrak kacang hijau Tiga cawan petri disiapkan, ditimbang dan dipanaskan dahulu hingga bobot tetap pada oven dengan suhu 105°C. Silika yang telah dihaluskan disiapkan, kemudian dipanaskan dahulu dalam oven. Saat 3 cawan petri mencapai bobot tetap, ekstrak ditimbang ± 0,5 g replikasi 3 kali dan masing- masing cawan berisi ekstrak tersebut ditambahkan ± 0,5 g silika. Ketiga cawan petri tersebut kemudian dimasukkan dalam oven bersuhu 50°C, hingga bobot tetap selisih kadar air 0,25 bb. Saat kadar air ekstrak lebih dari 10 bb, ekstrak dimasukkan dalam desikator dengan menggunakan batu gamping. d. Pemerian ekstrak kacang hijau Ekstrak kacang hijau diamati warna, bau, bentuk dan rasa.

4. Kromatografi lapis tipis ekstrak kacang hijau

a. Preparasi sampel Lima mg ekstrak kacang hijau , dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1 mL. b. Optimasi fase gerak Sampel ekstrak kacang hijau ditotolkan pada pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm Wolf, 2012 dengan menggunakan pipa kapiler 3 spot penotolan untuk 3 fase gerak, kemudian dielusi dengan 3 jenis fase gerak, yang dipilih sesuai dengan acuan Wagner dan Bladt 1996, sebagai berikut.: 1 Fase gerak nonpolar = n-heksana : etil asetat 2:3 vv 2 Fase gerak semipolar = kloroform : metanol 7:3 vv 3 Fase gerak polar = etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air 100:11:11:20 vv c. Deteksi secara fisik Pelat KLT hasil elusi dikeringkan pada suhu ruang, kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm, hasil elusi dari ketiga fase gerak tersebut kemudian dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi.

5. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas ekstrak kacang

hijau a. Preparasi pereaksi semprot DPPH Pereaksi DPPH dibuat 0,2 bv dalam pelarut metanol, disimpan dalam wadah gelap dan tertutup Marston, 2011. b. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal dengan pereaksi DPPH Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan untuk disemprot dengan pereaksi DPPH, hasil positif ditandai dengan adanya bercak kuning- putih dengan latar ungu pada pelat KLT.

6. Identifikasi senyawa pada ekstrak kacang hijau dengan reagen

semprot a. Preparasi sampel Lima mg ekstrak kacang hijau, dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1 mL, kemudian dielusi dengan fase gerak optimum. b. Identifikasi senyawa dengan reagen semprot Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi senyawa dengan menggunakan beberapa reagen semprot diantaranya yaitu, reagen Dragendorff, AlCl 3 , FeCl 3 , sitroborat, vanilin sulfat, kemudian diamati dan dihitung nilai Rf dari bercak yang terbentuk.

7. Uji perbandingan profil kromatografi lapis tipis KLT ekstrak

kacang hijau, ekstrak kulit kacang hijau, dan keping biji kacang hijau a. Preparasi sampel Lima mg ekstrak kacang hijau, kulit kacang hijau dan 5 mg ekstrak keping biji kacang hijau dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1 mL. b. Kromatografi lapis tipis ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau Sampel ekstrak kacang hijau, ekstrak kulit kacang hijau dan ekstrak keping biji kacang hijau ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm. Kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm, dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi. Kemudian pelat tersebut disemprot dengan pereaksi DPPH.

8. Uji kualitatif aktivitas UV

protection ekstrak kacang hijau a. Preparasi pereaksi � −karoten Pereaksi � −karoten dibuat 0,05 bv dalam pelarut kloroform, disimpan dalam wadah gelap dan tertutup Marston, 2011. b. Optimasi intensitas cahaya flouresensi Pelat KLT kosong tanpa elusi disiapkan, kemudian pelat tersebut dicelupkan dalam pereaksi � −karoten dan warnanya diukur dengan parameter warna. Pelat tersebut kemudian disinari dengan menggunakan lampu UV dalam kotak flouresensi, perubahan warna yang terjadi diukur dengan parameter warna pada tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Posisi dari lampu UV diatur dalam posisi tinggi 100 cm, sedang 50 cm, rendah 35 cm dan dihitung intensitas cahaya dengan alat light meter. Tiap posisi lampu dilakukan uji dengan replikasi 5 kali. Perubahan warna yang terjadi dihitung rata-rata dan SD. c. Uji kualitatif UV protection � −karoten bleaching test Pelat KLT hasil elusi yang telah kering dicelupkan dalam pereaksi � −karoten, sebelum dimasukan dalam kotak flouresensi warna pelat KLT tersebut diukur dengan menggunakan parameter warna. Pelat KLT tersebut kemudian disinari sinar UV dalam kotak flouresensi hasil optimasi yaitu pada ketinggian 50 cm dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter, diamati pada tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Uji tersebut direplikasi 5 kali dan perubahan warnanya dihitung raat-rata dan standar deviasi.

9. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak kacang hijau

a. Pembuatan media TSB cair Tiga g media TSB 30gL dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave. b. Pembuatan media agar Tiga g media TSB 30gL ditambahkan 1,2 agar dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave. c. Pembuatan larutan Mc-Farland 0,5 1,6 x 10 8 CFU Larutan Barium klorida 1,175 bv 0,05 mL ditambahkan dengan 9,95 mL larutan 1 bv asam sulfat Schwalbe, Moore, Goodwin, 2007. d. Pembuatan saline water 0,9 bv NaCl 0,9 g ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL aquadest. e. Preparasi bakteri uji Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli atau S.aureus. Kultur bakteri induk dari media miring diambil 1 ose dan dikulturkan pada media TSB cair, diinkubasi selama 18 jam. f. Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli atau S.aureus, deret larutan standard Mc Farland disiapkan. Sebanyak 2 tabung dibuat, masing-masing diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5 konsentrasi mikroba 1,6 x 10 8 CFUmL dengan penambahan bakteri uji. g. Penyimpanan kultur bakteri Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, 0,5 mL diambil dan dimasukkan dalam microtube. Gliserol 5 vv ditambahkan dari 0,5 mL kultur bakteri yaitu 25 x 10 -3 mL pada masing-masing microtube, dihomogenkan, diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator bersuhu 37°C. disimpan dalam frezzer. h. Pembuatan kontrol kontaminasi media Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara pour plate , dibiarkan memadat, diinkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan. i. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. 100 µL bakteri diinokulasikan secara spreading. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan. j. Pembuatan kontrol positif Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. Sebanyak 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL aquadest, diambil sebanyak 75;100;150 µg masing-masing dimasukkan dalam paper disk dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri tersebut. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan. d. KLT ekstrak kacang hijau Pelat KLT dan 5 mgmL ekstrak kacang hijau dalam etanol disiapkan untuk ditotolkan sebanyak 75;100;150 µg dengan menggunakan mikropipet, dielusi dengan fase gerak kloroform:metanol 7:3 vv, pelat tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dibuat 2 kali replikasi sebagai acuan dan sebagai pelat uji bioautografi. e. Bioautografi Pelat KLT hasil elusi yang telah kering, metode kontak dilakukan dengan media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading, metode kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut diangkat Inkubasi selama 18 jam, hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut.

10. Triturasi

a. Preparasi sampel triturasi Ekstrak kacang hijau ditimbang 5 g, dicampurkan dan dihomogenkan dengan 5 g sea sand yang telah dibersihkan, ditambahkan sedikit metanol, dan didiamkan selama satu malam. b. Triturasi dengan pelarut n-heksana Hasil campuran sea sand dengan ekstrak kacang hijau kemudian ditambahkan n-heksana 5 mL, divorteks, disentrifugasi, pelarut kemudian diambil dan disaring. Penambahan n-heksana pada solut campuran sea sand dan ekstrak, divorteks, disentrifugasi, bagian pelarut diambil dan disaring, diulangi 2 - 5 kali hingga pelarut menjadi bening. Pelarut tersebut kemudian dipekatkan sebagai hasil triturasi n-heksana. Campuran sea sand dan ekstrak kemudian dikeringkan dari n-heksana pada suhu ruang selama 1 jam. c. Triturasi dengan pelarut kloroform : metanol 7:3 vv Campuran sea sand dan ekstrak yang telah kering kemudian ditambahkan 5 mL kloroform : metanol 7:3 vv, divorteks, disentrifugasi, pelarut kemudian diambil dan disaring. Penambahan n-heksana pada solut campuran sea sand dan ekstrak, divorteks, disentrifugasi, bagian pelarut diambil dan disaring, diulangi 2-5 kali hingga pelarut menjadi bening. Pelarut tersebut kemudian dipekatkan sebagai hasil triturasi kloroform : metanol 7:3 vv. Campuran sea sand dan ekstrak kemudian disimpan. d. Uji Kromatografi lapis tipis KLT hasil triturasi Ekstrak, hasil triturasi n-heksana, dan hasil triturasi kloroform: metanol 7:3 vv disiapkan dalam kadar 5mgmL dalam etanol. Kemudian ditotolkan dalam pelat KLT masing-masing, dengan jarak elusi 5 cm dengan fase gerak kloroform : metanol 7:3 vv. Profil KLT dari ketiga kromatogram tersebut diamati dan dideteksi dengan lampu UV 254 nm, 366 nm dan dilakukan pengarangan dengan reagen semprot asam sulfat 5 vv.

11. Kromatografi kolom

a. Preparasi sampel untuk uji kromatografi lapis tipis Hasil triturasi n-heksana ditimbang 2,5 mg dilarutkan dalam 0,5 mL n- heksana. b. Uji kromatogri lapis tipis KLT untuk optimasi fase gerak kolom Hasil preparasi sampel ditotolkan pada pelat KLT, sejumlah 4 totol. Disiapkan 4 fase gerak yaitu: n-heksana : kloroform 50:50 vv, n-heksana : kloroform 25:75 vv, kloroform, dan kloroform : metanol 98:2 vv, kemudian pelat KLT tersebut dielusi dengan fase gerak tersebut dan diamati. c. Preparasi sampel untuk kolom kromatografi Hasil triturasi n-heksana sebanyak 300 mg ditimbang dan dicampurkan dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan perbandingan 1:1. d. Preparasi kolom kromatografi Kapas yang akan digunakan dibilas dahulu dengan n-heksana. Kolom kromatografi disiapkan dengan susunan dari bawah yaitu, kapas, silika gel 60 untuk kolom kromatografi sekitar 3 cm, sampel yang telah dicampur dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi sekitar 0,5 cm, silika gel 60 untuk kolom kromatografi 1 cm, dan ditutup dengan kapas. e. Kromatografi kolom gradien Kolom kromatografi yang telah disiapkan, akan dialirkan beberapa fase gerak dengan urutan sebagai berikut ini, yaitu, n-heksana : kloroform 50:50 vv, 40:60 vv, 30:70 vv, 20:80 vv, 10:90 vv, kloroform 100, kloroform : metanol 98:2 vv, 96:4 vv, 94:6 vv, 92:8 vv, 90:10 vv, masing-masing disiapkan 5 mL dan tiap 2 mL hasil gradien kolom kromatografi ditampung. f. Kromatografi lapis tipis KLT untuk konfirmasi hasil kromatografi kolom gradien Setiap 2 mL hasil kolom kromatografi dikumpulkan, KLT dilakukan dan diamati profil KLT nya. Profil KLT hasil kolom kromatografi yang sama disatukan, kemudian dipekatkan dan dihitung rendemen hasil. g. Penyimpanan isolat Isolat hasil pemekatan dilarutkan mengguanakan pelarut yang sesuai dengan konsentrasi 1 mg100 µL, kemudian dipekatkan dan disimpan dalam freezer .

12. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas isolat senyawa

ekstrak kacang hijau a. Preparasi sampel Isolat ekstrak kacang hijau disiapkan dengan konsentrasi masing-masing 1mgmL dengan menggunakan pelarut yang sesuai. b. Kromatografi lapis tipis KLT isolat senyawa ekstrak kacang hijau Sampel isolat di totolkan pada pelat kromatografi lapis tipis KLT masing-masing isolat 10; 20; 30 µL, sehingga diperoleh mass loading, yaitu 10; 20; 30 µg pada pelat KLT tersebut, dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol 7:3 vv dan dikeringkan pada suhu ruang. c. Uji kualitatif penangkapan radikal bebas Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan untuk disemprot dengan pereaksi DPPH 0,2 bv dalam metanol, hasil positif ditandai dengan adanya bercak kuning-putih dengan latar ungu pada pelat KLT. Perubahan warna pada pelat KLT dari ungu menjadi kuning-putih diamati dan diukur waktu perubahan warnanya.

13. Uji kualitatif aktivitas

UV protection isolat senyawa ekstrak kacang hijau a. Preparasi sampel Isolat ekstrak kacang hijau disiapkan dengan konsentrasi masing-masing 1mgmL dengan menggunakan pelarut yang sesuai. b. Kromatografi lapis tipis KLT isolat senyawa ekstrak kacang hijau Sampel isolat di totolkan pada pelat kromatografi lapis tipis KLT masing-masing isolat 10; 20; 30 µL, sehingga diperoleh mass loading yaitu 10; 20; 30 µg pada pelat KLT tersebut, dielusi dengan jarak 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol 7:3 vv dan dikeringkan pada suhu ruang. c. Uji kualitatif UV protection Pelat KLT hasil elusi yang telah kering dicelupkan dalam pereaksi � −karoten 0,05 bv dalam kloroform, sebelum dimasukan dalam kotak flouresensi warna pelat KLT tersebut diukur dengan menggunakan parameter warna. Pelat KLT tersebut kemudian disinari sinar UV dalam kotak flouresensi hasil optimasi dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter, diamati tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15.

14. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat senyawa ekstrak kacang

hijau a. Preparasi sampel Isolat ekstrak kacang hijau disiapkan dengan konsentrasi masing-masing 1mgmL dengan menggunakan pelarut yang sesuai. b. Pembuatan media agar Media TSB sebanyak 3 g ditambahkan 1,2 bv agar dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave. c. Pembuatan saline water 0,9 bv NaCl sebanyak 0,9 g ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL aquadest. d. Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah S. aureus, disiapkan deret larutan standard Mc Farland. Tabung diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mc Farland 0,5 konsentrasi mikroba 1,6. 10 8 CFUmL. e. Pembuatan kontrol kontaminasi media Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara pour plate , dibiarkan memadat, diinkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan. f. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan. g. Pembuatan kontrol positif Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 5 mL aquadest, diambil sebanyak 5;7,5;10 µg masing-masing ditotolkan dalam paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri tersebut. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan. h. Uji kualitatif antibakteri Isolat dengan konsentrasi 1 mgmL disiapkan. Paper disc tersebut diisikan isolat senyawa dengan mass loading 50;100;200 µg kemudian dikeringkan pada petri steril, setelah kering diletakkan dalam media berkoloni S. aureus . Selama 18 jam diinkubasi, hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut.

15. Identifikasi senyawa dari isolat aktif ekstrak kacang hijau

a. Kromatografi lapis tipis KLT isolat ekstrak kacang hijau Isolat ekstrak kacang hijau dalam konsentrasi masing-masing 1 mgmL disiapkan. Tiap isolat ditotolkan 10 µL pada pelat KLT, dielusi dengan jarak elusi 5 cm, menggunakan fase gerak kloroform : metanol 7:3 vv dan dikeringkan dalam suhu ruang. b. Deteksi secara fisik Pelat KLT hasil elusi dikeringkan pada suhu ruang, kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm dan 366 nm, hasil elusi kemudian dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi. c. Indentifikasi senyawa dengan reagen semprot Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi senyawa dengan menggunakan beberapa reagen semprot diantaranya yaitu, reagen Dragendorff, aluminium chloride AlCl 3 , ferric chloride FeCl 3 , vanilin sulfat, kemudian diamati dan dihitung nilai Rf dari bercak yang terbentuk.

16. Bagan alur penelitian

a. Bagan alur penelitian ekstrak kacang hijau Kacang hijau Simplisia kacang hijau Ekstrak kacang hijau Hasil triturasi n-heksana Uji aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection dan antibakteri secara kualitatif Hasil triturasi Kloroform : metanol 7:3 Isolat Bercak KLT ekstrak kacang hijau yang aktif Isolat aktif Uji aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection dan antibakteri secara kualitatif Proses pembuatan simplisia Ekstraksi : - Maserasi - Penyaringan - Penguapan - Pemekatan Kromatografi kolom , dengan step gradien Metode triturasi b. Bagan alur penelitian ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau Kacang hijau Kulit biji kacang hijau Keping biji kacang hijau Simplisia kulit biji kacang hijau Simplisia keping biji kacang hijau Ekstrak kulit biji kacang hijau Ekstrak keping biji kacang hijau Bagian kacang hijau yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkapan radikal bebas kacang hijau Pengupasan kacang hijau Proses pembuatan simplisia Ekstraksi - Kromatografi lapis tipis - Uji penangkapan radikal bebas 42 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Sampel

Determinasi sampel dilakukan dengan tujuan untuk memastikan kebenaran identitas dari sampel yang akan digunakan, sehingga kemungkinan kesalahan dalam pengambilan sampel yang akan digunakan dalam penelitian dapat dihindari. Determinasi sampel dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Berdasarkan hasil determinasi menunjukkan sampel yang digunakan adalah Phaseolus radiatus L. atau dikenal sebagai kacang hijau. Hal ini dibuktikan dengan adanya surat determinasi lampiran 1 yang dikeluarkan oleh Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Namun berdasarkan Plant Resources of South-East Asia 2015 disebutkan bahwa Vigna radiata L. merupakan nama sinonim dari Phaseolus radiatus L. 1753. Saat ini beberapa lembaga seperti United States Departement of Agriculture 2015 dan Plant Resources of South-East Asia 2015 menyebutkan bahwa nama spesies dari kacang hijau adalah Vigna radiata L. , oleh sebab itu penulis menggunakan nama Vigna radiata L. sebagai nama spesies dari kacang hijau dalam penelitian ini.

B. Hasil Pengumpulan dan Penyiapan Bahan

Kacang hijau yang digunakan diperoleh dari PT. Super Indo dengan batch number : 8-993408-010226, pemilihan kacang hijau dibeli di supermarket ini didasarkan karena penulis mengalami kesulitan menemukan petani kacang hijau dan kacang hijau dengan kualitas yang bagus dipasaran. Sortasi basah kemudian dilakukan pada kacang hijau tersebut untuk memisahkan sampel kacang hijau dengan pengganggu seperti tanah, debu, dan kacang hijau yang rusak. Selanjutnya pencucian dengan air mengalir dilakukan untuk menghilangkan kotoran yang melekat di kacang hijau, dilanjutkan dengan pengeringan kacang hijau. Proses pengeringan dilakukan dengan menghamparkan kacang hijau pada tampah dan ditutupi kain hitam yang diberi sedikit ruang sirkulasi udara dibawah sinar matahari, penggunaan kain hitam ini bermaksud agar tidak terjadi kontak langsung dari matahari dan meratakan pemanasan ke kacang hijau. Akhir pengeringan ditandai dengan perubahan warna menjadi lebih gelap dari sebelum dijemur. Setelah kacang hijau tersebut telah kering dilakukan sortasi kering, untuk menghilangkan pengotor yang mungki mencemari saat proses pengeringan berlangsung. Biji kacang hijau tersebut kemudian diserbuk dan disimpan dalam wadah kedap udara dengan silika penyerap lembab untuk menjaga kelembapan saat penyimpanan serbuk simplisia. Proses susut pengeringan diakukan pada serbuk simplisia kacang hijau untuk mengetahui kadar air pada simplisia. Prinsip dari susut pengeringan yaitu pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada temperatur 105ºC selama 30 menit atau sampai berat konstan, yang dinyatakan dalam nilai prosen. Metode susut pengeringan identik dengan kadar air, dalam keadaan apabila bahan tidak mengandung minyak menguap dan sisa pelarut organik menguap. Berdasarkan uji susut pengeringan yang telah dilakukan didapatkan kadar air simplisia kacang hijau yaitu 9,05 bb dengan hasil perhitungan terlampir lampiran 3. Kadar air tersebut sudah sesuai dengan ketentuan kadar air ≤ 10 bb dalam Keputusan Mentri Kesehatan RI NOMOR : 661IMENKESSKVII1994 tentang persyaratan obat tradisional. Dalam penelitian ini pembuatan simplisia kulit kacang hijau dan keping biji kacang hijau juga dilakukan, proses diawali dengan pemisahan kulit kacang hijau dengan isi keping biji kacang hijau. Kulit kacang hijau dan keping bijinya kemudian melewati proses pembuatan simplisia yang sama dengan proses simplisia kacang hijau, diawali dengan sortasi basah, pencucian, pengeringan, sortasi kering, penyerbukan dan penyimpanan menggunakan wadah tertutup yang telah diberi silika penyerap lembab.

C. Hasil Ekstraksi