b. Optimasi fase gerak
Sampel ekstrak kacang hijau ditotolkan pada pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm Wolf, 2012 dengan menggunakan pipa kapiler 3 spot penotolan
untuk 3 fase gerak, kemudian dielusi dengan 3 jenis fase gerak, yang dipilih sesuai dengan acuan Wagner dan Bladt 1996, sebagai berikut.:
1 Fase gerak nonpolar
= n-heksana : etil asetat 2:3 vv 2
Fase gerak semipolar = kloroform : metanol 7:3 vv
3 Fase gerak polar
= etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air 100:11:11:20 vv
c. Deteksi secara fisik
Pelat KLT hasil elusi dikeringkan pada suhu ruang, kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm, hasil elusi dari ketiga fase
gerak tersebut kemudian dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi.
5. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas ekstrak kacang
hijau
a. Preparasi pereaksi semprot DPPH
Pereaksi DPPH dibuat 0,2 bv dalam pelarut metanol, disimpan dalam wadah gelap dan tertutup Marston, 2011.
b. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal dengan pereaksi DPPH
Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan untuk disemprot dengan pereaksi DPPH, hasil positif ditandai dengan adanya bercak kuning-
putih dengan latar ungu pada pelat KLT.
6. Identifikasi senyawa pada ekstrak kacang hijau dengan reagen
semprot
a. Preparasi sampel
Lima mg ekstrak kacang hijau, dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1 mL, kemudian dielusi dengan fase gerak optimum.
b. Identifikasi senyawa dengan reagen semprot
Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi senyawa dengan menggunakan beberapa reagen semprot diantaranya yaitu, reagen
Dragendorff, AlCl
3
, FeCl
3
, sitroborat, vanilin sulfat, kemudian diamati dan dihitung nilai Rf dari bercak yang terbentuk.
7. Uji perbandingan profil kromatografi lapis tipis KLT ekstrak
kacang hijau, ekstrak kulit kacang hijau, dan keping biji kacang hijau
a. Preparasi sampel
Lima mg ekstrak kacang hijau, kulit kacang hijau dan 5 mg ekstrak keping biji kacang hijau dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1
mL. b.
Kromatografi lapis tipis ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau Sampel ekstrak kacang hijau, ekstrak kulit kacang hijau dan ekstrak
keping biji kacang hijau ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm. Kemudian pelat KLT tersebut dideteksi
menggunakan lampu UV 254 nm, dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi. Kemudian pelat tersebut disemprot dengan pereaksi DPPH.
8. Uji kualitatif aktivitas UV
protection ekstrak kacang hijau
a. Preparasi pereaksi � −karoten
Pereaksi � −karoten dibuat 0,05 bv dalam pelarut kloroform,
disimpan dalam wadah gelap dan tertutup Marston, 2011. b.
Optimasi intensitas cahaya flouresensi Pelat KLT kosong tanpa elusi disiapkan, kemudian pelat tersebut
dicelupkan dalam pereaksi � −karoten dan warnanya diukur dengan
parameter warna. Pelat tersebut kemudian disinari dengan menggunakan lampu UV dalam kotak flouresensi, perubahan warna yang terjadi diukur
dengan parameter warna pada tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Posisi dari lampu UV diatur dalam posisi tinggi 100 cm, sedang 50 cm, rendah 35
cm dan dihitung intensitas cahaya dengan alat light meter. Tiap posisi lampu dilakukan uji dengan replikasi 5 kali. Perubahan warna yang terjadi dihitung
rata-rata dan SD. c.
Uji kualitatif UV protection � −karoten bleaching test Pelat KLT hasil elusi yang telah kering dicelupkan dalam pereaksi
� −karoten, sebelum dimasukan dalam kotak flouresensi warna pelat KLT tersebut diukur dengan menggunakan parameter warna. Pelat KLT tersebut
kemudian disinari sinar UV dalam kotak flouresensi hasil optimasi yaitu pada ketinggian 50 cm dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter, diamati
pada tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Uji tersebut direplikasi 5 kali dan perubahan warnanya dihitung raat-rata dan standar deviasi.
9. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak kacang hijau
