F. Kromatografi
1. Definisi kromatografi lapis tipis KLT
Kromatografi merupakan proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam
berupa bahan padat ataupun porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan dalam dinding kolom. Dalam kromatografi cair, fase gerak
yang digunakan selalu cair Rohman, 2009. Kromatografi lapis tipis KLT terdiri atas fase diam dan fase gerak. Fase
diamnya berupa lapisan seragam uniform pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Penjerap yang
paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa. Rohman, 2009. Fase gerak kromatografi lapis tipis digunakan sebagai pelarut pengembang yang akan
bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik ascending, atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara
menurun descending Gandjar dan Rohman, 2007. Mekanisme sorpsi-desorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi Rohman, 2007.
Perlu adanya optimasi fase gerak dalam kromatografi lapis tipis. Sistem yang paling sederhana menggunakan 2 pelarut organik karena daya elusi
campuran kedua pelarut ini mudah diatur sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Beberapa petunjuk yang perlu diperhatikan dalam optimasi fase gerak, yaitu :
1 Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang tinggi, karena KLT
merupakan teknik yang sensitif 2
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak diantara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
3 Pemisahan dengan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak
akan menentukan kecepatan migrasi solut sehingga menentukan nilai Rf 4
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik menggunakan campuran pelarut sebagai fase gerak seperti campuran air dan methanol dengan
perbandingan tertentu Rohman, 2009. Perlu adanya deteksi terhadap bercak hasil pemisahan KLT, karena pada
umumnya bercak pemisahan KLT tidak berwarna. Deteksi secara kimia yang biasa digunakan dengan menggunakan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan
sehingga bercak terlihat jelas. Deteksi secara fisika dapat dilakukan dengan menampakkan bercak dengan fluoresensi dibawah sinar ultraviolet, untuk
senyawa yang dapat berfluoresensi akan membuat bercak terlihat lebih jelas. Berikut ini adalah cara-cara kimiawi mendeteksi bercak hasil pemisahan
KLT: 1
Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional
tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Pemanasan terkadang dibutuhkan untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak
2 Mengamati lempeng KLT dibawah lampu ultraviolet yang dipasang pada
panjang gelombang emisi 254 atau 366 nm untuk menampakkan solut sebagai
bercak yang gelap atau bercak yang berflouresensi terang pada dasar yang berflouresensi seragam
3 Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu
dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklatan
4 Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.
5 Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer
Rohman, 2009. Kromatografi lapis tipis KLT bila dikombinasikan dengan metode
deteksi biologis dan kimia, merupakan teknik yang efektif dan tidak mahal untuk pengujian ekstrak tanaman. Kombinasi KLT dengan metode deteksi biologi,
dikenal sebagai KLT bioautografi Marston, 2011. KLT umumnya digunakan untuk menentukan komponen dalam
campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai dan memantau
kromatografi kolom, melakukan screening untuk obat Gandjar dan Rohman, 2007.
2. Kromatografi kolom
Kategori