Tehnik pembenihan Tanaman 363
menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda
pula.Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi
dikotil berdaun lebar, monokotil gymnospermae, pakis, dan juga
moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon,
dan batang muda, merupakan- bagian yang mudah untuk
dediferensiasi dan menghasilkan kalus.
Eksplan yang telah disterilkan dikulturkan dalam media kultur
MS+BAP. Setelah terbentuk tunas, tunas tersebut disubkultur dalam
media multiplikasi MS+BAP dan beberapa komponen organik lainnya.
Suatu contoh prosedur dalam inisiasi kultur kalus, dapat diperoleh dengan
menumbuhkan potongan wortel dekat lingkaran kambium, di dalam media
MS. Tahapannya adalah sebagai berikut.
Tahap awal adalah proses persiapan eksplan. Wortel yang
segar dan yang kotor cuci wortel dengan detergent, kupas kulit
luarrnya, lalu iris dalam potongan kecil. Sterilkan dalam alkohol 70
selama 1 menit. Bilas dengan aquadest steril. Rendam dalam
larutan clorox 20X, seiama 10 menit. Bilas lagi 3 kali dalam aquadest.
Bagian ujung eksplan yang keluar dari larutan sterilisasi, dipotong ambil
bagian kambium dan tanam di dalam larutan 77:2 media ES dengan
hormon 2,4-D.
Mempersiapkan media dan lingkungan kultur, gunakan media
MS yang diberi tambahan 2,4-D 1 mgl; sukrosa 30 gr1, agar 8 grl.
Setelah dipanaskan untuk melarutkan agar, media
dimasukkan ke dalam botol 75 ml masing-masing 15 ml, lalu ditutup
dengan aluminium foil. Setelah diautoclave, media disimpan dulu
selama 3 hari dalam keadaan gelap. Untuk media yang tidak
terkontaminasi dipergunakan untuk inisiasi kultur.
Tiga eksplan ditanam dalam satu botol media. Ketiga eksplan
ini dianggap sebagai satu unit percobaan. Kultur diberi label yang
berisi keterangan tentang jenis tanaman, bagian yang diambil,
kode media, dan tanggal tanam. Kultur diletakkan pada rak
terbuka di dalam ruang kultur dengan temperatur rata-rata 250C
dalam diffuse light. Periksa kultur setelah satu minggu, untuk melihat
perkembangan kultur.
Setelah 4 minggu, kalus yang friable dapat disubkultur pada
media baru. Untuk melihat sel, dapat dipergunakan mikroskop
cahaya dengan pembesaran 1000 kali, setelah sel itu diberi larutan
toluidine blue 0.05 wv.
Lakukan pengamatan pertumbuhan kalus. Untuk itu parameter
pertumbuhan yang digunakan untuk pengaruh media, eksplan,
dan faktor-faktor lain, adalah
berat basah kalus, berat kering kalus, dan diameter kalus
9.6 Kultur Suspensi Sel
Kalus yang diperoleh dari kultur kalus, dapat dipindahkan ke media cair
untuk inisiasi kultur suspensi sel, atau dipindahkan ke media lain untuk
diregenerasi menjadi tanaman. Regenerasi tanaman dapat melalui
organogenesis atau embriogenesis. Dalam organogenesis, kalus dapat
membentuk akar atau tunas, atau kedua- duanya. Dalam kultur kalus yang hanya
membentuk akar, seringkali dijumpai
Di unduh dari : Bukupaket.com
364
kesulitan untuk memperoleh pucuk dari akar tersebut.
Gambar 9.10 Pengamatan pertumbuhan kalus
Tetapi bila regenerasi terjadi melalui pembentukan tunas terlebih dahulu, maka
kemungkinan induksi akar lebih mudah. Sedangkan dalam embryogenesis,
pembentukan pucuk dan akar sudah terintegrasi dalam satu sumber, dan
merupakan suatu sistem tertutup closed system yang tidak berhubungan dengari
jaringan asalnya. Kultur suspensi sel merupakan suatu sistem yang sesuai
untuk mempelajari metabolisme sel, pengaruh berbagai persenyawaan pada
sel, serta diferensiasi sel.
Sedangkan dalam segi praktisnya, kultur suspensi sel dipergunakan sebagai
sumber: y
Sel-sel untuk protoplasma y
Sel-sel yang akan diberi perlakuan mutagen kimia
y Sel untuk studi hubungan host-
patogen adalah fitopatologi y
Massa untuk produksi bahan-bahan sekunder
y Sel-sel untuk media seleksi.
Inisiasi kultur dari kalus, merupakan cara yang paling sederhana dan banyak
dilakukan. Kalus yang segar kira-
kira 200 - 250 mg dapat dipindahkan ke 40 ml media cair dalam botol erlenneyer
125 ml. Kultur kemudian diletakkan pada shaker dan dikocok dengan kecepatan
90-100 rpm secara terus menerus. Penanbahan auksin dalam suspensi
menghasilkan kultur sel yang terpisah dispersed. Kultur suspensi dikocok
supaya: y
Pemecahan gumpalan se1 menjadi agregat kecil dan sel tunggal,
y Distribusi sel yang merata dalam
media, y
Pertukaran gas antara media dan udara.
Dalam suspensi sel dikenal dua kelompok kultur, yaitu: kultur batch dan,
continuous. Kultur sel batch adalah kultur dalam media hara dengan volume tetap,
tetapi dengan konsentrasi hara yang berubah sesuai dengan tingkat
pertumbuhan sel. Sebagai contoh: misainya kultur berisi 20-75 ml media.
Selama masa inkubasi, terjadi pertambahan biomass yang mengikuti
pola sigmold.Setelah mencapai suatu masa tertentu, sel berhenti membelah
karena kehabisan hara dan akumulasi metabolik yang toxic. Setelah mencapai
fase ini, kultur batch harus diperbaruidiperbanyak.
Perbanyakan dilakukan dengan memindahkan sejumlah kecil sel dan
disubkultur pada media baru. Kultur continuous merupakan kultur sel jangka
panjang dengan suplai hara yang konstan dalam wadah yang besar. Dalam kultur ini
terdapat sistem untuk sirkulasi mengeluarkan media lama dan ditambah
dengan media yang baru. Dalam kultur sel continuous terdapat dua tipe, yaitu
tipe tertutup closed type dan tipe terbuka open type
Dalam tipe tertutup, sel bertambah terus tanpa dipanen, hanya media yang
disirkulasi. Sedangkan pada tipe terbuka, penapbahan media baru disertai juga
dengan panen sel. Tipe kultur contnuous yang terbuka dapat menggunakan
chemostat atau turbidostat. Chemostat menggunakan standard konsentrasi
bahan-bahan kimia tertentu yang mengatur laju pertumbuhan, misalnya
kadar N, P, atau glukosa. Persenyawaan N, P, atau glukosa, diatur sedemikian
rupa pada suatu level yang tetap untuk mengatur populasi sel yang tertentu.
Di unduh dari : Bukupaket.com
Tehnik pembenihan Tanaman 365
Pada tipe kultur continuous dengan turbidostat, diatur jumlah tertentu, yang
diukur dengan turbiditas. Kerapatan biomass yang melebihi turbiditas
-
yang sudah ditentukan, akan dikeluarkan.
Kultur suspensi sel dapat diinisiasi dari kalus.
Gambar 9.11 Multiplikasi tanaman
9.7 Multiplikasi.
