362 Timbang kinetin 100 mg dan
tuang ke dalam galas piala 100 ml yang berisi 70 ml aquadest.
Sambil diaduk-aduk, ditetesi dengan larutan HCl 1 N dan
dipanaskan sebentar hingga bahan benar-benar larut menjadi jernih.
Setelah larut dan dingin, larutan dipindahkan ke dalam labu takar
100 ml untuk ditepatkan volumenya pada 100 ml, dengan
menambahkan aquadest. Larutan yang telah jadi dipindahkan ke
dalam botol simpan 100 ml, ditutup rapat, diberi label dan
disimpan dalam lemari es. Bila 1 ml larutan stok ini ditambahkan
dalaa pembuatan 1 liter media akan memberi perlakuan kinetin 1 ppm.
Ketentuan pembuatan larutan stok auksin dan sitoinin ini dapat
berlaku umum untuk golongan zat pengatur tumbuh yang lain. Zat
pengatur tumbuh yang bereaksi asam seperti auksin dan giberelin,
dapat dilarutkan dengan bantuan menambahan larutan NaOH basa,
atau menggunakan bahan pelarut alkohol 40, atau dengan
pemanasan. Sedangkan zat
pengatur tumbuh yang bereaksi basa seperti golongan sitokinin,
dapat dibantu pelarutannya dengan menambahkan rapa tetes larutan
HCl 1 N, atau dengan pemanasan.
Hal-hal yang perlu diperhatikan pada larutan stok:
x Larutan stok unsur hara,
sebaiknya tidak disimpan lebih dari dua bulan sebelum
dipergunakan. Stok vitamin dan zat pengatur tumbuh,
sebaiknya digunakan segar kurang dari 2 minggu. Oleh
karena itu sebelum membuat larutan stok, harus ditentukan
dahulu kebutuhan media, jadwal pembuatan media, dan
semua sarana pembuatan media harus benar-benar sudah siap.
x Larutan stok yang telah mengalami pengendapan dan
yang sudah ditumbuhi mikroorganisme, tidak boleh
digunakan lagi dibuang.
x Semua alat-alat gelas alat ukur, takar, wadah sebelum
dipergunakan untuk membuat larutan, harus dibilas dulu
dengan aquadest.
x Setelah selesai digunakan atau sebelum digunakan lagi, harus
pula segera dibilas dengan aquadest. Bila tidak digunakan
lagi, tempatkanlah pada rak penyimpanan secara terbalik
supaya kering dan bagian dalamnya tidak berdebu.
Cara membuat media dengan larutan stok, dilakukan dengan
metode pengenceran. Untuk itu perlu diketahui benar-benar
volume kebutuhan larutan stok masing-masing. sebagai contoh,
akan dibuat 1 liter media MS dengan perlakuan 1 ppm NAA dan
2 ppm kinetin. Media yang dibuat adalah media padat dengan 0.8
agar dan mengandung 3 gula sukrosa.
9.5 Inisiasi tunas
Inisiasi adalah proses memulai suatu kegiatan kultur jaringan.
Inisiasi dapat dilakukan melalui akar, daun, dan jaringan
meristemlainnya. Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian
tanaman, tetapi organ yang berbeda
Di unduh dari : Bukupaket.com
Tehnik pembenihan Tanaman 363
menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda
pula.Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi
dikotil berdaun lebar, monokotil gymnospermae, pakis, dan juga
moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon,
dan batang muda, merupakan- bagian yang mudah untuk
dediferensiasi dan menghasilkan kalus.
Eksplan yang telah disterilkan dikulturkan dalam media kultur
MS+BAP. Setelah terbentuk tunas, tunas tersebut disubkultur dalam
media multiplikasi MS+BAP dan beberapa komponen organik lainnya.
Suatu contoh prosedur dalam inisiasi kultur kalus, dapat diperoleh dengan
menumbuhkan potongan wortel dekat lingkaran kambium, di dalam media
MS. Tahapannya adalah sebagai berikut.
Tahap awal adalah proses persiapan eksplan. Wortel yang
segar dan yang kotor cuci wortel dengan detergent, kupas kulit
luarrnya, lalu iris dalam potongan kecil. Sterilkan dalam alkohol 70
selama 1 menit. Bilas dengan aquadest steril. Rendam dalam
larutan clorox 20X, seiama 10 menit. Bilas lagi 3 kali dalam aquadest.
Bagian ujung eksplan yang keluar dari larutan sterilisasi, dipotong ambil
bagian kambium dan tanam di dalam larutan 77:2 media ES dengan
hormon 2,4-D.
Mempersiapkan media dan lingkungan kultur, gunakan media
MS yang diberi tambahan 2,4-D 1 mgl; sukrosa 30 gr1, agar 8 grl.
Setelah dipanaskan untuk melarutkan agar, media
dimasukkan ke dalam botol 75 ml masing-masing 15 ml, lalu ditutup
dengan aluminium foil. Setelah diautoclave, media disimpan dulu
selama 3 hari dalam keadaan gelap. Untuk media yang tidak
terkontaminasi dipergunakan untuk inisiasi kultur.
Tiga eksplan ditanam dalam satu botol media. Ketiga eksplan
ini dianggap sebagai satu unit percobaan. Kultur diberi label yang
berisi keterangan tentang jenis tanaman, bagian yang diambil,
kode media, dan tanggal tanam. Kultur diletakkan pada rak
terbuka di dalam ruang kultur dengan temperatur rata-rata 250C
dalam diffuse light. Periksa kultur setelah satu minggu, untuk melihat
perkembangan kultur.
Setelah 4 minggu, kalus yang friable dapat disubkultur pada
media baru. Untuk melihat sel, dapat dipergunakan mikroskop
cahaya dengan pembesaran 1000 kali, setelah sel itu diberi larutan
toluidine blue 0.05 wv.
Lakukan pengamatan pertumbuhan kalus. Untuk itu parameter
pertumbuhan yang digunakan untuk pengaruh media, eksplan,
dan faktor-faktor lain, adalah
berat basah kalus, berat kering kalus, dan diameter kalus
9.6 Kultur Suspensi Sel
