Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

22

C. Bahan Penelitian 1.

Bahan utama a. Daun M. tanarius diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. b. Hewan uji yang digunakan, yaitu tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan dengan berat badan 150-250 g, diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bahan kimia

a. Pelarut ekstrak, yaitu metanol dan air, metanol diperoleh dari Bratachem Yogyakarta yang dikemas oleh PT. Brataco Cikarang, Bekasi dan aquadest diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Hepatotoksin karbon tetraklorida, produksi MERCK Darmstadt, Germany, diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. c. CMC-Na 1 sebagai bahan untuk membuat suspensi ekstrak metanol-air daun M. tanarius, diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Olive oil BERTOLLI ® untuk membuat larutan karbon tetraklorida 50. e. Aquadest diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. f. Blanko pengujian ALT dan AST menggunakan aquabidestilata yang diproduksi oleh PT. Ikapharmindo Putramas Jakarta. 23 g. Reagen serum ALT dan AST DiaSys Germany untuk mengukur aktivitas ALT dan AST. h. Kontrol serum ALT-AST COBAS ® PreciControl ClinChem Multi 2 RocheHitachi analyzer.

D. Alat Penelitian

1. Alat pembuatan serbuk kering daun M. tanarius

Alat untuk pembuatan serbuk kering daun M. tanarius adalah oven, mesin penyerbuk, dan timbangan analitik.

2. Alat pembuatan ekstrak metanol-air daun M. tanarius

Seperangkat alat gelas, yaitu Erlenmeyer, beaker glass, gelas ukur, labu ukur, batang pengaduk, cawan porselen, dan pipet tetes; shaker; timbangan analitik; dan oven.

3. Alat uji hepatoprotektif

Seperangkat alat gelas, yaitu beaker glass, labu ukur, gelas ukur, batang pengaduk, dan tabung reaksi; timbangan analitik; spuit injeksi per oral dan intraperitoneal; pipa kapiler; vitalab mikro Microlab 200, Merck; stopwatch, vortex ; sentrifuge.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman M. tanarius L.

Determinasi tanaman M. tanarius dilakukan hingga ke tingkat spesies dengan cara mencocokkan ciri-ciri tanaman dengan herbarium yang telah ada di 24 Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Bagian tanaman yang digunakan dalam melakukan determinasi tanaman meliputi daun, batang, biji, bunga, dan buah.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun M. tanarius yang masih segar dan berwarna hijau. Daun M. tanarius dipetik dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada bulan Mei 2012.

3. Pembuatan serbuk daun M. tanarius

Daun M. tanarius dicuci bersih di bawah air mengalir kemudian dikeringanginkan. Setelah itu, dilakukan pengeringan di bawah sinar matahari dan ditutup menggunakan kain berwarna hitam agar terhindar dari kerusakan akibat paparan sinar matahari langsung dan juga menciptakan pemanasan yang merata. Pengeringan dilanjutkan menggunakan oven pada suhu 50°C selama 24 jam. Daun yang telah kering kemudian diserbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40.

4. Penetapan kadar air serbuk daun M. tanarius

Penetapan kadar air serbuk daun M. tanarius dilakukan secara sederhana dengan metode Gravimetri menggunakan alat Moisture Balance. Sebanyak 5 g serbuk daun M. tanarius dimasukkan ke dalam alat Moisture Balance, kemudian diratakan dan ditimbang sebagai bobot serbuk sebelum pemanasan. Serbuk dipanaskan pada suhu 110 o C selama 15 menit. Setelah dipanaskan, serbuk ditimbang ulang sebagai bobot serbuk sesudah pemanasan. Bobot serbuk daun M. 25 tanarius sebelum dan sesudah pemanasan kemudian dijadikan sebagai dasar untuk menghitung persentase kadar air. 5. Pembuatan ekstrak metanol-air daun M. tanarius Serbuk kering daun M. tanarius diekstraksi secara maserasi. Sebanyak 10 g serbuk kering daun M. tanarius dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 50 pada suhu kamar selama 3 x 24 jam dengan kecepatan 140 rpm. Hasil maserasi disaring dengan kertas saring, lalu cairan penyari dipisahkan menggunakan rotary vacuum evaporator . Ekstrak kemudian dipindahkan ke dalam cawan porselen dan dimasukkan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 50°C hingga didapatkan ekstrak dengan bobot tetap susut pengeringan 0. Rendemen ekstrak merupakan selisih berat cawan berisi ekstrak kental dan berat cawan kosong. Rata-rata rendemen dihitung dari 6 replikasi rendemen ekstrak. Persentase rendemen ekstrak daun M. tanarius merupakan banyaknya ekstrak kental yang didapatkan dari 1 kg serbuk daun M. tanarius.

6. Penetapan konsentrasi pekat ekstrak

Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit per oral. Pembuatan konsentrasi pekat dilakukan dengan melarutkan 1,92 g ekstrak dalam labu ukur terkecil dengan pelarut yang sesuai, yakni CMC-Na 1. Labu ukur terkecil yang tersedia adalah labu ukur 5 ml sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan, yaitu sebesar 0,384 gml atau 384 mgml atau 38,4 bv Andini, 2010. 26

7. Penetapan dosis ekstrak metanol-air daun M. tanarius

Dasar penetapan peringkat dosis adalah berat badan tertinggi hewan uji tikus dan separuh pemberian maksimal secara per oral, yaitu 2,5 ml. Penetapan dosis tertinggi ekstrak metanol-air daun M. tanarius adalah sebagai berikut: D x BB = C x V D x 0,250 kg = 384 mgml x 2,5 ml D = 3840 mgkgBB Peringkat dosis II ditetapkan dengan menurunkan sepertiga dari dosis tertinggi ⅓ x 3840 mgkgBB = 1280 mgkgBB dan peringkat dosis III ditetapkan dengan menurunkan sepertiga dari peringkat dosis II ⅓ x 1280 mgkgBB = 426 mgkgBB. Dosis ekstrak metanol-air daun M. tanarius yang digunakan dalam penelitian adalah 3840, 1280, 426 mgkgBB.

8. Pembuatan suspending agent CMC-Na 1

CMC-Na 1 digunakan untuk mensuspensikan ekstrak metanol-air daun M. tanarius . Lebih kurang 1,0 g CMC-Na yang telah ditimbang seksama didispersikan ke dalam air mendidih hingga volume 100 ml.

9. Pembuatan larutan hepatotoksin karbon tetraklorida 50

Hepatotoksin karbon tetraklorida dibuat dengan cara mencampurkan 50 ml karbon tetraklorida dengan 50 ml olive oil sehingga diperoleh konsentrasi 50. 27

10. Uji pendahuluan

a. Penentuan dosis karbon tetraklorida Penetapan dosis karbon tetraklorida bertujuan untuk mengetahui dosis karbon tetraklorida yang mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus yang ditandai dengan peningkatan aktivitas serum ALT dan AST paling tinggi. Dosis karbon tetraklorida yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan penelitian sebelumnya. Janakat and Al-Merie 2002 melaporkan bahwa dosis karbon tetraklorida 2 mlkgBB mampu meningkatkan aktivitas serum ALT dan AST pada tikus dengan jalur pemberian secara intraperitoneal. b. Penentuan waktu pencuplikan darah Menurut Janakat and Al-Merie 2002, kenaikan serum ALT dan AST akan terjadi pada waktu 24 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Dalam penetapan waktu pencuplikan darah ini, 5 hewan uji tikus diambil darah sebelum diberi perlakuan karbon tetraklorida untuk mengetahui aktivitas ALT dan AST dalam keadaan normal. Lima hewan uji tersebut kemudian diberi perlakuan karbon tetraklorida 50 dengan dosis 2 mlkgBB secara intraperitoneal dan diambil darah pada jam ke-24 dan ke-48 setelah pemejanan. Setelah darah dicuplik, dilakukan pengukuran aktivitas serum ALT dan AST. c. Penentuan waktu pemejanan hapatotoksin karbon tetraklorida Tiala 2013 melaporkan bahwa praperlakuan jangka waktu 30 menit merupakan waktu paling efektif ekstrak metanol-air daun M. tanarius 3840 28 mgkgBB untuk menghasilkan efek hepatoprotektif pada tikus jantan teriduksi karbon tetraklorida 2 mlkgBB. Pemejanan senyawa hepatotoksin, yaitu karbon tetraklorida dilakukan 30 menit setelah pemejanan ekstrak metanol-air daun M. tanarius . Aktivitas ALT dan AST diukur setelah 24 jam pemejanan senyawa hepatotoksin.

11. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Sejumlah 30 ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi perlakuan karbon tetraklorida 50 dengan dosis 2 mlkgBB secara intraperitoneal. Kelompok II kontrol negatif diberi perlakuan olive oil 100 dengan dosis 2 mlkgBB secara intraperitoneal. Kelompok III kontrol ekstrak diberi perlakuan ekstrak metanol-air daun M. tanarius dengan dosis 3840 mgkgBB secara per oral. Kelompok IV sampai dengan kelompok VI masing-masing diberi ekstrak metanol-air daun M. tanarius dengan dosis 3840, 1280, dan 426 mgkgBB secara per oral, 30 menit kemudian diberi hepatotoksin karbon tetraklorida 2 mlkgBB secara intraperitoneal. Dua puluh empat jam setelah pemberian hepatotoksin karbon tetraklorida, pada semua kelompok perlakuan dilakukan pencuplikan darah melalui sinus orbitalis mata untuk pengukuran aktivitas serum ALT dan AST.

12. Pembuatan serum

Darah diambil melalui sinus orbitalis mata tikus dengan bantuan pipa kapiler, ditampung melewati dinding ke dalam tabung Eppendorf, dan didiamkan 29 kurang lebih selama 15 menit. Darah kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan diambil bagian supernatannya serum.

13. Penetapan aktivitas serum kontrol dan serum ALT-AST

Alat yang digunakan untuk menganalisis aktivitas serum ALT-AST adalah vitalab mikro Microlab-200. Pengukuran aktivitas serum ALT dan AST dilakukan di Laboratorium Biokimia - Anatomi Fisiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penetapan aktivitas serum kontrol bertujuan untuk mengetahui validitas dan reliabilitas alat yang digunakan. Analisis dilakukan dengan cara mencampurkan 800 μL reagen I dengan 200 μL reagen II, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicampurkan dengan 100 μL serum kontrol, dihomogenkan dengan vortex, lalu dibaca absorbansi setelah 2 menit. Rentang nilai aktivitas serum kontrol yang sebenarnya adalah 33,9-48,9 UL. Analisis fotometri serum ALT dan AST, masing-masing dilakukan dengan cara sebagai berikut: 800 μL reagen I dicampur dengan 200 μL reagen II, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicampurkan dengan 100 μL serum darah tikus, dihomogenkan dengan vortex, lalu dibaca absorbansi setelah 2 menit.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas serum ALT-AST dianalisis dengan metode Kolmogorov- Smirnov untuk mengetahui distribusi data setiap kelompok dan analisis varian untuk melihat homogenitas varian antar kelompoknya sebagai syarat analisis parametrik. Jika data terdistribusi normal dan homogen, untuk mengetahui 30 perbedaan masing-masing kelompok, maka dilanjutkan dengan analisis variansi pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna p0,05 atau tidak bermakna p0,05. Akan tetapi, apabila distribusi normal dan data tidak homogen, maka dilakukan analisis non parametrik dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas serum ALT-AST tiap kelompok. Setelah itu, untuk melihat perbedaan antar kelompok dilakukan uji Mann Whitney. Efek hepatoprotektif ekstrak metanol-air daun M. tanarius pada tikus terinduksi karbon tetraklorida dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: 31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan menentukan dosis paling efektif pemberian ekstrak metanol-air daun M. tanarius sebagai hepatoprotektor pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida dengan pengaruh praperlakuan jangka waktu 30 menit. Tolok ukur dari efek hepatoprotektif ekstrak metanol-air daun M. tanarius dievaluasi secara kuantitatif berdasarkan uji aktivitas serum ALT-AST. Efek hepatoprotektif ditunjukkan dengan adanya penurunan aktivitas serum ALT-AST akibat pemberian ekstrak metanol-air daun M. tanarius pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida.

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk membuktikan kebenaran bahwa tanaman yang akan digunakan dalam penelitian merupakan tanaman yang dimaksud, yaitu tanaman Macaranga tanarius L. Dari determinasi yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa tanaman yang akan digunakan dalam penelitian adalah benar merupakan tanaman Macaranga tanarius L. Lampiran 4.

B. Penetapan Kadar Air Serbuk Daun M. tanarius

Penetapan kadar air serbuk dilakukan untuk memenuhi persyaratan yang menyatakan bahwa serbuk yang baik memiliki kadar air kurang dari 10 Dirjen POM, 1995. Penetapan kadar air serbuk daun M. tanarius dilakukan dengan alat 32 Moisture Balance menggunakan metode Gravimetri. Serbuk dipanaskan pada suhu 110 o C selama 15 menit. Hasil pengujian menyatakan bahwa serbuk daun M. tanarius memiliki kadar air sebesar 7,59. Hal ini berarti bahwa serbuk daun M. tanarius telah memenuhi persyaratan serbuk yang baik.

C. Bobot Pengeringan Tetap dan Rendemen Ekstrak Metanol-Air

Daun M. tanarius Ekstrak metanol-air daun M. tanarius dibuat menggunakan metode maserasi. Digunakan metode maserasi karena peralatan yang digunakan dan cara pengerjaan sederhana. Metode maserasi cocok digunakan untuk menyari simplisia daun M. tanarius karena daun M. tanarius mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, yaitu metanol:air 50:50. Hal ini berdasarkan penelitian Matsunami, et al. 2006 bahwa senyawa antioksidan yang dapat diperoleh dari daun M. tanarius adalah hasil isolasi ekstrak metanol yang bersifat polar. Maserasi simplisia daun M. tanarius dilakukan selama 3 x 24 jam agar semua senyawa aktif yang terkandung dalam daun M. tanarius dapat tersari sempurna. Ketika proses maserasi telah selesai maka dilakukan penyaringan menggunakan corong Buchner dan kertas penyaring, dengan bantuan pompa vakum. Setelah cairan tersaring, dilakukan pemisahan cairan penyari dengan zat tersari, yaitu menggunakan alat rotary vacuum evaporator. Prinsip kerja rotary vacuum evaporator adalah destilasi, yaitu memisahkan cairan penyari dan zat tersari dengan cara penurunan tekanan pada labu alas bulat dan pemutaran labu alas bulat sehingga pelarut dapat menguap lebih cepat di bawah titik didih. Zat tersari yang telah terpisah dari cairan penyari selanjutnya dimasukkan ke dalam 33 cawan porselen dan disimpan dalam oven dengan suhu 50 o C hingga didapatkan ekstrak kental dengan bobot pengeringan yang tetap, yaitu susut pengeringan 0. Bobot pengeringan tetap dengan susut pengeringan 0 digunakan sebagai parameter non spesifik standarisasi ekstrak metanol-air daun M. tanarius. Pengukuran parameter non spesifik bertujuan untuk menghitung berat zat setelah dilakukan pengeringan pada temperatur 50 o C. Ekstrak daun M. tanarius dalam cawan porselen ditimbang setiap 1 jam selama 24 jam hingga diperoleh berat konstan. Seribu gram serbuk daun M. tanarius menghasilkan 237,51 g ekstrak dengan rendemen 23,75.

D. Uji Pendahuluan

1. Penentuan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida

Hepatotoksin yang digunakan dalam penelitian ini adalah karbon tetraklorida. Penentuan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida dilakukan untuk mengetahui dosis karbon tetraklorida yang mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus steatosis, ditandai dengan adanya peningkatan aktivitas serum ALT- AST. Dosis karbon tetraklorida yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2 mlkgBB. Penetapan dosis ini berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, dimana pada dosis tersebut dengan rute pemberian secara intraperitoneal terbukti mampu meningkatkan aktivitas serum ALT-AST Janakat dan Al-Merie, 2002.