mendapatkan bentuk permukaan respon dan gambar garis bentuk dari hasil ekstrak yang diperoleh.
3. Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa Aktif Ekstrak Biji Kamandrah Sebagai Bahan Laksatif
a. Penentuan Kandungan Fitokimia.
Penentuan kandungan fitokimia pada bagian biji tanaman kamandrah dilakukan untuk mengetahui kandungan aktif yang terdapat dalam ekstrak heksana dan etanol,
menggunakan metode Harborne 1987, meliputi senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid dan tannin.
Alkaloid
Ekstrak ditambahkan 10 ml kloroform dan beberapa tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan H
2
SO
4
2M. Pada fraksi asam ditambahkan pereaksi Meyer, Dragendorf, dan Wagner secara sendiri-sendiri. Jika
terdapat endapan putih dengan pereaksi Meyer, endapan merah jingga dengan pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner, maka dinyatakan positif
terdapat alkaloid.
Flavonoid
Contoh dengan bobot tertentu ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama 5 menit, kemudian ditambah serbuk Mg, 0,2 ml HCl pekat, dan beberapa tetes
amil alkohol. Larutan dikocok dan dibiarkan terjadi pemisahan. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna coklat pada lapisan amil alkohol.
SteroidTriterpenoid
Contoh ditambahkan etanol lalu dipanaskan dan disaring. Filtrat diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter diambil untuk diuji dengan pereaksi
Lieberman Buchard. Terbentuknya warna merah ungu menyatakan positif mengandung triterpenoid dan warna hijau positif mengandung steroid.
Tanin
Contoh ekstrak sebanyak 1 g ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring. Ke dalam sebagian filtrat ditambahkan FeCl
3
1. Adanya tanin ditandai dengan terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman.
b. Analisis Komponen Lemak Menggunakan Gas Chromatography GC
Untuk mengetahui komponen asam lemak yang terkandung dalam ekstrak heksana dilakukan identifikasi menggunakan Gas Chromatography GC. Proses
analisis dilakukan sebagai berikut : Sebanyak 20 mg ekstrak heksana ditimbang dalam tabung bertutup teflon,
kemudian ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol. Selanjutnya dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Tabung diangkat dan didinginkan pada suhu
kamar, ditambahkan larutan NaCl jenuh 2 ml dan heksana 1 ml serta dikocok selama 1- 2 menit. Fasa organik dibiarkan terpisah dengan baik.
Tabel 8. Kondisi, Spesifikasi dan Program Pengaturan Gas Chromatography GC
Kondisi GC Spesifikasi dan Program Pengaturan
Kolom N2
H2 Suhu Injektor
Suhu Detektor Suhu Kolom
Volume Standar Volume Contoh
DEGS 10 dalam kromosorb WAW 6 feed x 18 inci 20 mlmenit
30 mlmenit 200
o
C 250
o
C Suhu terprogram
Suhu awal 150
o
C--Æ ditahan 5 menit Suhu Akhir I 190
o
CÆ ditahan 10 menit Suhu akhir II 220
o
C-Æ ditahan 15 menit 2
µ L
2 µ
L Lapisan heksana dipindahkan kedalam botol kecil berisi 0,1 g NaSO
4
anhidrat dan dibiarkan selama 20 menit. Selanjutnya lapisan heksana dipindahkan ke dalam
botol kecil dan contoh siap diinjeksikan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi operasi seperti pada Tabel 8.
c. Identifikasi Ekstrak Heksana Menggunakan Gas Chromatography GC dan Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS
Pemisahan dan identifikasi komponen mudah menguap dari masing-masing konsentrat biji kamandrah, dilakukan dengan menggunakan alat GC-MS dan
seperangkat komputer dengan program Class-5000 Ver. 1.1 Anonim, 1994. Kondisi, spesifikasi dan program pengaturan alat GC-MS untuk pemisahan-identifikasi
komponen mudah menguap biji kamandrah dilakukan menggunakan metode Kumara 1998.
Penyuntikan sebanyak 1 µ
L ke alat GC-MS dilakukan, masing-masing terhadap 1 udara tanpa contoh dan pelarut, 2 pelarut dietil eter, 3 pelarut dietil eter yang
telah dipekatkan, 4 konsentrat mudah menguap hasil ekstraksi 90 menit terhadap serbuk biji kamandrah hasil ekstraksi, 5 konsentrat mudah menguap hasil ekstraksi 90
menit terhadap residu serbuk biji kamandrah yang telah dikurangi lemak-minyaknya, dan 6 konsentrat mudah menguap hasil ekstrak 90 menit terhadap residu serbuk biji
kamandrah yang telah dikurangi komponen polarnya. Identifikasi komponen mudah menguap dilakukan dengan bantuan komputer melalui proses pencocokan pola spektra
massa masing-masing komponen mudah menguap biji kamandrah yang terpisah dengan menggunakan koleksi spektra massa dari NIST National Institute Standard and
Tecnology-USA. Fraksi yang dianalisis disuntikkan pada GS-MS sejumlah 1
µ l dengan kondisi
alat, spesifikasi dan pengaturan yang telah disesuaikan, seperti pada Tabel 9. Penafsiran spektra massa GC-MS dilakukan dengan bantuan komputer dengan
menggunakan database software Class 5000 Shimadzu dengan database National
Institute Standard and Tecnology NIST yaitu NIST 12 dan NIST 62 yang memiliki lebih dari 62.000 pola.
Tabel 9. Kondisi, Spesifikasi, dan Program Pengaturan Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS
Kondisi GC Spesifikasi dan Program Pengaturan
Kolom Gas Pembawa
Detektor Suhu interface
Suhu Injektor Volume injeksi
Teknik injeksi Waktu sampling
Program suhu: -suhu awal
-laju kenaikan suhu -suhu akhir
Kolom kapiler HP 5 dengan panjang 30 meter, diameter dalam 0.32 mm, tebal film 0,25
µ m
Helium, tekanan 40-45 Kpa MS mass spectrometer
230
o
C 230
o
C 1
µ L
splitsplitless 0.5 menit
40
o
C, ditahan selama 5 menit 4
o
Cmenit 225
o
C, ditahan selama 5 menit
Kondisi MS Spesifikasi dan Program Pengaturan
Energi ionisasi Kisaran massa
Interval Resolusi
Waktu 1.20 kV
33-400 0.5 detik
1000 1.6-56.0 menit
Untuk menetapkan nilai Linier Retention Indices LRI dari setiap spektra yang muncul dilakukan dengan perhitungan menggunakan data waktu retensi dari n-alkana
standar C
8
– C
22
yang disuntikkan dengan konsentrasi 0,1 pada kondisi yang sama dengan kondisi penyuntikan contoh. Perhitungan LRI dilakukan menggunakan rumus :
LRI
x
= tx – tn tn + 1 + n X 100 dengan,
LRIx = indeks retensi linier komponen x tx = waktu retensi komponen x menit
tn = waktu retensi standar alkana dengan n buah atom karbon yang muncul sebelum komponen x menit
tn + 1 = waktu retensi standar alkana dengan n + 1 buah aton karbon yang muncul setelah komponen x menit
n = jumlah atom karbon n-alkana yang muncul sebelum komponen x. Selanjutnya spektra tersebut juga dibandingkan dengan pola spektra yang
tersedia pada pustaka. Setelah itu dilakukan konfirmasi identifikasi dengan
membandingkan LRI komponen hasil perhitungan dengan nilai LRI suatu komponen tertentu dari pustaka. Senyawa teridentifikasi dapat dipastikan bila nilai LRI hasil
perhitungan memiliki nilai yang sama atau hampir sama dengan nilai LRI dari pustaka. d. Identifikasi Ekstrak Etanol Menggunakan Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry LC-MS
Analisis kandungan senyawa dalam ekstrak etanol dilakukan untuk mengetahui komponen senyawa apa saja yang terdapat dalam ekstrak etanol tersebut. Oleh karena
ekstrak etanol merupakan ekstrak yang bersifat polar, maka dilakukan identifikasi menggunakan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-MS. Tatacara analisis
ekstrak etanol menggunakan LC-MS dilakukan sebagai berikut : Fraksi yang dianalisis disuntikkan pada LC-MS sejumlah 1
µ l dengan kondisi
alat, spesifikasi dan pengaturan yang telah disesuaikan. Penafsiran spektra massa LC- MS dilakukan dengan bantuan komputer dengan menggunakan database software Class
5000 Shimadzu dengan database National Institute Standard and Tecnology NIST yaitu NIST 12 dan NIST 62 yang memiliki lebih dari 62.000 pola. Untuk mencari nilai
Linier Retention Indices LRI dari setiap spektra yang muncul dilakukan dengan perhitungan menggunakan data waktu retensi dari n-alkana standar C
8
– C
22
yang disuntikkan dengan konsentrasi 0,1 pada kondisi yang sama dengan kondisi
penyuntikan contoh, seperti pada Tabel 10. Selanjutnya spektra tersebut juga dibandingkan dengan pola spektra yang
tersedia pada pustaka. Setelah itu dilakukan konfirmasi identifikasi dengan membandingkan LRI komponen hasil perhitungan dengan nilai LRI suatu komponen
tertentu dari pustaka. Senyawa teridentifikasi dapat dipastikan bila nilai LRI hasil perhitungan memiliki nilai yang sama atau hampir sama dengan nilai LRI dari pustaka.
Tabel 10. Kondisi, Spesifikasi dan Program Pengaturan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-MS
Kondisi LC Spesifikasi dan Program Pengaturan
Program Suhu
Laju kenaikan Suhu Suhu akhir
Solvent cut time
Kondisi MS
Energi detektor Kisaran massa
Kisaran waktu 80
o
C per menit 350
o
C, ditahan selama 20 menit 1 menit
1,2 kV 43 – 700
Interval 0,5 detik pada 1,2 – 20 menit
e. Uji Toksisitas Menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test BSLT Terhadap larva udang Artemia salina.
Metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa aktif baru yang berasal dari tumbuhan tingkat tinggi biasanya dilakukan dengan uji toksisitas larva
udang. Metode ini cukup praktis, cepat, mudah, murah dan akurasi tinggi. Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas
farmakologis suatu senyawa. Senyawa aktif yang dikandung ekstrak kasar tumbuhan akan menyebabkan tingkat kematian yang tinggi. Pemeriksaan toksisitas diperlukan
untuk mengetahui berapa konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan sehingga dapat diketahui jumlah penggunaan konsentrasi yang tepat. Tingkat konsentrasi yang
dapat menyebabkan keracunan ditentukan dengan konsentrasi letal 50 LC
50
. LC
50
adalah konsentrasi dari suatu bahan yang menyebabkan 50 kematian dalam suatu populasi. LC
50
dapat digunakan untuk menentukan toksisitas suatu zat. Data kematian hewan uji yang diperoleh dapat diolah untuk mendapatkan nilai LC
50
dengan selang kepercayaan 95 dengan menggunakan probit analysis method yang pertama kali
dikemukakan oleh Finney. Nilai LC
50
ini dijadikan sebagai batas konsentrasi tertinggi pada penentuan varian konsentrasi ekstrak dalam uji enzimatik.
Uji mortalitas larva udang Artemia salina Leach merupakan salah satu metode uji bioaktif pada penelitian senyawa bahan alam Laughlin dan Ferrigni., 1991.
Metode ini telah digunakan untuk berbagai pengamatan bioaktivitas antara lain untuk mengetahui residu pestisida, anastetik lokal, senyawa turunan morfin, mikotoksin,
karsinogenesitas suatu senyawa, serta polutan air laut Meyer et al., 1982. Beberapa keuntungan dari uji bioaktif menggunakan larva udang adalah waktu uji yang cepat,
murah, tidak perlu terlalu aseptis, sederhana, tidak memerlukan keahlian khusus, dan tidak memerlukan peralatan khusus. Menurut Meyer et al., 1982 apabila hasil
penelitian menunjukkan nilai LC
50
1000 ppm maka bahan yang diuji dikatakan memiliki potensi bioaktivitas.
Uji toksisitas menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test BSLT Terhadap larva udang Artemia salina ini dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk
menentukan nilai LC
50
sebelum melakukan uji toksisitas terhadap hewan uji mencit. Diharapkan hasil pengujian ini sebagai gambaran untuk menentukan dosis pengujian
selanjutnya.
Tatacara Percobaan
Telur udang ditempatkan pada kotak penetasan yang telah disekat pada bagian tengahnya. Kemudian diberi air laut secara perlahan sampai setengah dari volume total
dan bagian kotak yang berisi telur udang ditutup dengan timah aluminum, kotak yang telah ditutup ditempatkan dibawah sinar lampu, telur ditetaskan selama 24 jam, telur
yang telah menetas akan menjadi larva yang kemudian akan berenang ke bagian kotak yang tidak tertutup oleh timah aluminum, sedangkan cangkangnya akan tertinggal
sehingga tidak mengganggu pada saat pengambilan larva untuk uji BSLT. Setelah 48 jam larva udang siap digunakan untuk pengujian.
Pembuatan larutan induk. Sejumlah 2 mg ekstrak etanol dan ekstrak heksan ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 1 ml air laut, contoh sukar larut ditambah 10
µ l
DMSO sebelum penambahan air laut, dikocok hingga homogen. Larutan induk 200 ppm yang telah dibuat dilakukan pengenceran sehingga didapat dosis 200 dan 20 ppm.
Pembuatan larutan seri. Untuk membuat larutan contoh konsentrasi 200 ppm dengan cara menyiapkan sebanyak 100
µ l larutan induk, kemudian dipipet ke dalam
botol kecil lalu ditambah 900 µ
l air laut kemudian dikocok hingga homogen. Pembuatan larutan contoh konsentrasi 20 ppm dilakukan sebanyak 100
µ l dari larutan
dengan konsentrasi 200 ppm dipipet ke dalam botol kecil lalu ditambah 900 µ
l air laut kemudian dikocok hingga homogen.
Sebanyak 10-12 ekor larva udang dimasukkan ke dalam botol kecil yang diisi 100
µ l air laut, kemudian ditambah 100
µ l larutan contoh. Selanjutnya botol kecil yang
telah berisi larva udang dalam air laut tersebut didiamkan di bawah sinar lampu selama 24 jam. Setiap konsentrasi larutan uji dilakukan tiga kali ulangan.
Pengamatan
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menggunakan kaca pembesar loop, kemudian jumlah larva yang mati dihitung.
Analisis Data
Data yang diperoleh dihitung menggunakan analisis probit. Rumus yang digunakan untuk menghitung toksisitas Brine Shrimp Lethality Test BSLT adalah
sebagai berikut: a. Persentase kematian mortalitas
Jumlah akumulasi mati AM Mortalitas =
X 100 Jumlah AM + AH
dengan, AM = Akumulasi Mati
AH = Akumulasi Hidup b. LC
50
dengan menggunakan persamaan garis regresi linier Y = a + bX
4. Penentuan Dosis Efektif Khasiat dan Keamanan Ekstrak Terstandar Sebagai Bahan Laksatif
