Kadar Protein HASIL DAN PEMBAHASAN

5 PEMANFAATAN SUPERNATAN Lactobacillus plantarum L. lactis FNCC 0086 SEBAGAI PENGHAMBAT PERTUMBUHAN BAKTERI PATOGEN PADA DANGKE SUSU SAPI ABSTRACT The aims of the study are to determine the minimum inhibitory concentration MIC of L. plantarum L. lactis FNCC 0086 supernatant in inhibiting the growth of Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 25922 test bacteria, determine the effect of the additional L. plantarum L. lactis FNCC 0086 supernatant and cows milk fat into dangke against the growth of test bacteria. Minimum inhibitory concentration was determined based on the lowest concentration of the supernatant that show no growth in the media. Data of pathogenic bacteria growth analyzed with ANOVA test with a 2x2 factorial design, which 1 st factor was the addition of L. plantarum L. lactis FNCC 0086 supernatant with or without addition of supernatant and the second factor is the addition of fat content 1 and 2 and time observations were made on days 0, 2nd, 4th, 6th, and 8th. The results which show significantly different, will be continued by using Duncan test. Results showed that the filtrate of fermented L. plantarum L. lactis FNCC 0086 was able to inhibit the growth of S. aureus ATCC 25923 and E. coli ATCC 25922 in vitro with the minimum inhibitory concentration MIC was 10. The L. plantarum L. lactis FNCC 0086 supernatant was able to depress the growth of E. coli ATCC 25922 in dangke, but S. aureus ATCC β59βγ didn‟t either. Key words: E. coli 25922, L. plantarum L. lactis FNCC 0086 supernatant, minimum inhibitory concentration MIC, S. aureus ATCC 25923

5.1 PENDAHULUAN

Dangke adalah makanan tradisional masyarakat Kabupaten Enrekang, Sulawesi Selatan yang dibuat dari susu. Dangke susu sapi memiliki kandungan nutrisi yang tinggi antara lain protein 23.8, lemak 14.8, kadar air 55.0, dan kadar abu 2.1 Hatta et al. 2013. Pembuatan dangke dilakukan melalui proses pemanasan susu, penggumpalan, dan selanjutnya dikemas menggunakan daun pisang. Salah satu kendala yang dialami dalam pengembangan dangke adalah masa simpan produk yang cukup singkat sehingga pemasarannya kurang menjangkau wilayah yang lebih luas. Diouf et al. 2012 melaporkan bahwa susu yang digumpalkan menggunakan getah pepaya memiliki pH 5.9-6.7, dan bertahan hanya sampai 24 jam pada suhu ruang. Dangke termasuk keju lunak soft cheese karena tidak diperam dan kandungan airnya di atas 40. Kandungan air yang tinggi menyebabkan dangke mudah terkontaminasi oleh bakteri patogen seperti Escherichia coli Paxson 2008. Kontaminasi dangke susu sapi oleh bakteri E. coli juga dilaporkan Hatta et al. 2013 sebesar 73. Beberapa serotipe E. coli menyebabkan diare pada anak- anak dan orang dewasa terutama di negara berkembang. Upaya pemerintah Indonesia untuk mencegah kontaminasi keju termasuk dangke yaitu dengan menentukan batas maksimal kandungan E. coli adalah 1 log cfu g -1 SNI 2009 . Dilaporkan bahwa supernatan hasil fermentasi Lactobacillus dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen Streptococcus sp., S. aureus, dan E. coli, bahkan supernatan yang sudah disimpan selama enam bulan tetap memiliki kemampuan antibakteri Khoiriyah et al. 2014. Delgado et al. 2001 melaporkan bahwa senyawa antimikrob yang diproduksi oleh L. plantarum strain LB17.2b, mampu menghambat bakteri Gram positif dan negatif, seperti: Enterococcus faecalis, S. viridans, S. aureus, S. carnosus, Listeria innocua, L. monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis, Salmonella sp., Aeromonas hydrophila, E. coli, Pseudomonas sp., P. aeruginosa, dan Klebsiella pneumoniae. Bakteri S. aureus merupakan bakteri Gram positif yang bersifat patogen, proteolitik, lipolitik, -hemolitik, dan memproduksi enterotoksin serta koagulase. E. coli termasuk ke dalam golongan koliform dan secara normal hidup di dalam usus besar dan kotoran manusia maupun hewan. E. coli adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang, dan tidak membentuk spora Fardiaz 1992. Dosis yang dapat menimbulkan gejala infeksi E. coli pada makanan berkisar antara 8 –9 log cfu g -1 . Bahan makanan yang sering terkontaminasi E. coli antara lain daging, ikan, telur, sayuran, buah, dan susu. Penelitian ini bertujuan menentukan kadar hambat minimum KHM supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dalam menghambat pertumbuhan S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922 serta mengetahui pengaruh penambahan supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dan lemak susu sapi ke dalam dangke terhadap pertumbuhan S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922. Manfaat penelitian ini adalah ditemukannya kadar hambat minimum dari supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 yang dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen. Diharapkan pada akhirnya supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dapat dimanfaatkan sebagai biopreservasi alami dangke yang aman dikonsumsi.

5.2 METODE

PENELITIAN Bakteri patogen sebagai bakteri uji adalah S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922. Baketri asam laktat yaitu L. plantarum L. lactis FNCC 0086. Alat dan bahan yang digunakan adalah buffered peptone waterBPW 0,1, Nutrient BrothNB, Muller-Hinton BrothMHB, de Man Rogosa and Sharpe BrothMRSB, Violet Red BileVRB agar, Vogel Johnson Agar VJA, Oxoid, Oxoid Ltd., Basingstoke, United Kingdom, API 50 CHL carbohydrate fermentation strips bioMérieux, Inc., Marcy lEtoile, Perancis, asam sulfat pekat, amil alkohol, aquades, NaOH 10, NaOH 0,1 N, H 3 BO 3 3, H 2 O 2 3, larutan standar Mc Farlan no. 1, larutan safranin, gentian violet, lugol, aseton, dan HCl. Bahan lain: susu sapi, larutan getah pepaya, daun pisang, dan cetakan tempurung kelapa. Isolat L. plantarum L. lactis FNCC 0086, S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922 dikonfirmasi dengan pewarnaan Gram dan uji katalase menggunakan H 2 O 2 3. Selanjutnya terhadap L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dilakukan uji API 50 CHL. Perolehan supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dilakukan berdasarkan Iyapparaj et al. 2013.

5.2.1 Penentuan Kadar Hambat Minimum KHM

Menentukan KHM dilakukan dengan menggunakan metode dilusi Sari et al. 2010; Ratsep et al. 2014 dengan beberapa konsentrasi supernatan yaitu: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90. Selanjutnya larutan uji tersebut dihomogenkan, dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kemudian diamati pertumbuhan bakteri dengan melihat ada tidaknya kekeruhan pada larutan uji. Selanjutnya dari masing-masing konsentrasi larutan uji diambil 0.1 mL dan disebar ke media spesifik untuk masing-masing jenis bakteri dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah 24 jam inkubasi, kembali dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan bakteri dan dihitung jumlah koloninya. Konsentrasi larutan uji yang tidak ada pertumbuhan bakteri uji pada media ditetapkan sebagai kadar hambat minimum KHM.

5.2.2 Pembuatan Dangke dan Penambahan Supernatan L. plantarum L.

lactis FNCC 0086 Sebagai Biopreservasi Pembuatan dangke mengacu kepada Hatta et al. 2013. Kadar lemak dalam krim ditentukan dengan metode Kieferle dan Charlotte Sudarwanto 2012. Supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dimasukkan ke dalam curd sebelum disaring. Perlakuan penambahan biopreservasi ke dalam dangke dilakukan dengan cara menambahkan supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 sebagai perlakuan dan tanpa ditambahkan supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 sebagai kontrol negatif. 5.2.3 Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri Uji Jumlah koloni dinyatakan dengan colony forming unit cfu per gram atau per mL atau luasan tertentu dari contoh cm 2 Morton 2001; Waluyo 2007. Perhitungan dilakukan menurut ketentuan Standard Plate Count SPC. Perhitungan terhadap S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922 dilakukan dengan menggunakan metode tuang pada medium VJA dan VRB agar. 5.2.4 Rancangan Penelitian dan Analisis Data Nilai KHM ditetapkan berdasarkan nilai konsentrasi terendah supernatan yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan dalam media. Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap pola faktorial 2x2. Faktor I: penambahan supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dengan penambahan dan tanpa penambahan supernatan dan faktor II: penambahan kadar lemak 1 dan 2 dan waktu pengamatan dilakukan pada hari ke-0, 2, 4, 6, dan 8 hari. Data yang diperoleh dianalisis secara sidik ragam dan apabila hasilnya berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan Mattjik dan Sumertajaya 2002.

5.3 HASIL DAN PEMBAHASAN

5.3.1 Rekultur dan Reidentifikasi Isolat BAL dan Bakteri Uji

Hasil reidentifikasi terhadap isolat yang diduga L. lactis FNCC 0086, S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922 diperoleh koloni yang seragam. Hasil pewarnaan Gram terhadap L. lactis FNCC 0086 menunjukkan isolat termasuk bakteri Gram positif, berbentuk batang, katalase negatif dan dapat tumbuh baik pada medium MRS agar Gambar 5.1. Hasil identifikasi menggunakan uji API 50 CHL system Biomerieux menunjukkan bahwa isolat tersebut adalah L. plantarum dengan validasi 99.9 Gambar 5.2. Hasil reidentifikasi secara morfologi dan biokimia terhadap L. lactis FNCC 0086 ternyata isolat tersebut adalah L. plantarum. Hal tersebut diduga terdapat kesalahan teknis saat penanganan identifikasi atau ordering isolat di laboratorium PAU UGM. Selanjutnya isolat BAL yang digunakan dalam penelitian ini ditulis sebagai L. plantarum L. lactis FNCC 0086. Identifikasi terhadap L. plantarum menggunakan uji API juga dilakukan oleh Prema 2013 dan Anas et al. 2014. Isolat L. plantarum diketahui memiliki kemampuan tumbuh pada kondisi asam yang tinggi. Kondisi asam disebabkan oleh akumulasi asam laktat yang diproduksi bakteri selama fermentasi secara homofermentatif Thiruneelakandan et al. 201 4 . Produk asam inilah yang dapat digunakan sebagai bahan aktif pengawet makanan Askari et al. 2012. Cisarova et al. 2009 juga melaporkan bahwa asam yang diproduksi L. plantarum mampu menghambat sejumlah bakteri Gram negatif, seperti Clostridium dan Enterobacteriaceae. Senyawa asam tersebut juga mampu menghambat bakteri Gram positif yang biasa merusak makanan seperti S. aureus. Hasil pewarnaan Gram terhadap S. aureus ATCC 25923 ditemukan bentuk bulat, bergerombol membentuk bulatan buah anggur. Bakteri tersebut termasuk bakteri Gram positif yang ditunjukkan dengan warna ungu sesuai dengan yang dilaporkan Harris et al. 2002. Kebanyakan galur S. aureus bersifat patogen dan memproduksi enterotoksin yang tahan panas. Beberapa galur, terutama yang bersifat patogen, memproduksi koagulase, bersifat pro teolitik, lipolitik dan - hemolitik. Hasil pewarnaan Gram terhadap E. coli ATCC 25922 ditemukan bentuk batang dan termasuk bakteri Gram negatif yang ditunjukkan dengan warna merah. Hasil tersebut sesuai dengan yang dilaporkan Ray dan Bhunia 2007. Hasil uji katalase terhadap E. coli ATCC 25922 adalah positif dengan ditandai terbentuknya gelembung. Hasil tersebut sesuai dengan yang dilaporkan Holt et al. 1994 bahwa E. coli adalah kelompok anaerobik fakultatif dan termasuk katalase positif.