Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop, butirometer Gerber, timbangan analitik, inkubator, autoklaf, tabung reaksi, cawan
petri, stirer, batang ose, penangas air, sumbat karet, pipet steril, gelas ukur, botol, termometer, panci, saringan plastik, tempurung kelapa, pH meter, higrometer,
oven, butirometer, sentrifuse, dan separator susu.
3.4 Metode Penelitian
3.4.1 Rekultur, Reidentifikasi, dan Preparasi Supernatan Isolat BAL disegarkan dalam 5 mL MRSB dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37
o
C. Kultur BAL berumur 24 jam kemudian dipupuk dalam MRS agar dan kembali diinkubasi selama 24 jam. Kultur dalam MRS agar kemudian
diidentifikasi secara morfologi dengan pewarnaan Gram dan uji katalase menggunakan H
2
O
2
3. Isolat dengan karakter gram positif, katalase negatif, dan tidak memproduksi gas selama fermentasi, lebih lanjut diuji kemampuannya
dalam memfermentasi 49 jenis karbohidrat untuk diidentifikasi mengkonfirmasi jenisnya menggunakan kit API 50 CHL Biomerieux, Perancis. Isolat umur 24
jam digoreskan pada medium MRS agar, selanjutnya disuspensikan pada medium API CHL dan dihomogenisasi. Suspensi isolat pada medium API CHL diteteskan
pada API CHL strip yang berisi substrat 49 macam karbohidrat, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 48 jam. Kemampuan isolat dalam
memfermentasi substrat diamati pada 24 dan 48 jam inkubasi. Perubahan warna dari biru gelap menjadi kuning dinyatakan sebagai perubahan yang positif. Hasil
yang diperoleh diolah dengan menggunakan software API 50 CHL sehingga didapatkan data jenis bakteri yang diuji.
Isolat L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dan E. coli ATCC 25922 dikonfirmasi dengan pewarnaan Gram dan uji katalase menggunakan H
2
O
2
3. Selanjutnya terhadap L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dilakukan uji API 50
CHL. Isolat L. plantarum L. lactis FNCC 0086 hasil identifikasi diinokulasikan ke dalam 100 mL medium MRSB dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24
jam Iyapparaj et al. 2013. Selanjutnya dilakukan pemisahan sel dengan supernatan menggunakan sentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit
pada suhu 4
o
C. Supernatan kemudian disaring menggunakan membran filter 0.2 μm dan disimpan pada suhu 4
o
C sebagai stok. Endapan berupa sel ditanam dalam cryoinstant sebagai stok isolat BAL dan disimpan dalam freezer suhu -18
o
C. Supernatan sebagai stok siap digunakan dalam setiap tahapan penelitian.
Isolat S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922 digunakan sebagai indikator. Terhadap kedua isolat dilakukan rekultur sebelum digunakan. Kedua
isolat dibiakkan dalam media BHI broth dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Setelah inkubasi selama 24 jam kemudian kedua isolat ditanam dalam
media MRSA dengan beberapa pengenceran hingga diperoleh koloni tunggal. Koloni tunggal yang diperoleh kemudian dilakukan pewarnaan Gram dan uji
katalase. Persiapan bakteri asam laktat dan bakteri uji tersebut dimaksudkan untuk mengetahui kemurniannya.
3.4.2 Uji Aktivitas Antibakteri dan Penentuan Kadar Hambat Minimum
KHM Menentukan KHM dilakukan dengan menggunakan metode dilusi Sari et
al. 2010; Ratsep et al. 2014. Sebanyak 5 mL larutan uji yang terdiri atas media NB, supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dan 6 log cfu mL
-1
bakteri patogen dimasukkan ke dalam tabung. Larutan uji dibuat dalam beberapa
konsentrasi supernatan yaitu: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian diamati pertumbuhannya dengan melihat ada tidaknya kekeruhan pada larutan uji.
Selanjutnya dari masing-masing konsentrasi larutan uji diambil 0.1 mL dan disebar ke media spesifik untuk masing-masing jenis bakteri dan diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh. Konsentrasi larutan uji yang tidak ada pertumbuhan bakteri ditetapkan
sebagai kadar hambat minimum KHM supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086.
3.4.3 Pembuatan
Dangke
Proses pembuatan dangke dalam penelitian ini menggunakan krim susu sapi yang ditambahkan ke dalam susu sapi segar. Penambahan krim merupakan upaya
untuk meningkatkan kadar lemak dangke susu sapi. Krim ditambahkan ke dalam susu sapi dengan kadar lemak 1 dan 2 gv dari volume susu. Kadar lemak
dalam krim ditentukan dengan metode Kieferle dan Charlotte Sudarwanto 2012. Susu kemudian dipanaskan dengan api kecil sampai
70
o
C, kemudian ditambahkan getah buah pepaya sehingga terjadi penggumpalan curd dan
dibiarkan hingga mendidih dan didinginkan. Setelah didinginkan kemudian ditambahkan supernatan L. plantarum L. lactis FNCC 0086 dan dibiarkan
selama 30 menit. Selanjutnya curd yang terbentuk disaring dan dimasukkan ke dalam cetakan yang terbuat dari tempurung kelapa sambil ditekan-tekan supaya
cairannya terpisah. Dangke yang terbentuk kemudian dibungkus dengan daun pisang.
3.4.4 Analisa Proksimat Dangke
Analisis proksimat dangke dilakukan menggunakan Standar Nasional Indonesia SNI 1992 dan
Association of Official Agricultural Chemists AOAC
1995 untuk mengetahui kadar air dan abu dengan metode gravimetri, kadar lemak dengan metode hidrolisis-Soxhlet, dan kadar protein dengan metode
Kjeldahl mikro. Kadar karbohidrat dihitung menggunakan rumus by difference, yaitu: 100 - protein + lemak + abu + air. Nilai pH ditentukan dengan
metode SNI 1998.
3.4.4.1 Penentuan Kadar Air
Metode yang digunakan dalam penentuan kadar air ini adalah metode oven dengan menghitung kehilangan bobot sampel setelah pengovenan. Sampel
ditimbang sebanyak 1 –2 gram di dalam cawan porselen bertutup yang sebelumnya
telah diketahui beratnya. Sampel dikeringkan menggunakan cawan porselen dalam oven pada suhu 102
–105
o
C selama 5 –6 jam. Sampel didinginkan dalam
desikator, kemudian ditimbang sampai diperoleh berat yang konstan. Perhitungan dalam menentukan kadar air dapat ditentukan melalui persamaan berikut:
