29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Pembuatan Media PDA Miring
Media PDA miring digunakan untuk melakukan pemurnian kapang endofit. Sebanyak 39 gram Potato Dextrose Agar dan ditambahkan dengan 1 liter
akuades. Kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer. Selanjutnya media dituang ke
dalam tabung masing-masing ±5 mL. Dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121
o
C. Tabung diletakkan dengan posisi miring ± 45
o
, biarkan media memadat di Laminar Air Flow Rustanti, 2007.
3. Pembuatan Media NA Nutrient Agar
Media NA digunakan untuk seleksi kapang endofit yang memiliki potensi sebagai antibakteri. Sebanyak 20 gram Nutrient Agar dan dimasukkan ke dalam
labu yang sudah berisi 1 liter akuades. Kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer.
Dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121 C.
Media dituang secara aseptis ke dalam cawan petri sebanyak masing-masing ±10 mL di Laminar Air Flow dan biarkan sampai memadat Rustanti, 2007.
4. Pembuatan Media NA Miring
Media NA miring dibuat dengan tujuan untuk melakukan peremajaan bakteri uji. Sebanyak 20 gram Nutrient Agar ditambahkan dengan 1 liter akuades.
Kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer. Selanjutnya media dituang ke dalam tabung
masing-masing ±5 mL. Dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121
o
C. Tabung diletakkan dengan posisi miring ± 45
o
, biarkan media memadat di Laminar Air Flow Rustanti, 2007.
5. Pembuatan Media NB Nutrient Broth
Pembuatan media Nutrient Broth digunakan untuk membuat kurva pertumbuhan bakteri yang akan diujikan. Sebanyak 8 gram Nutrient Agar
kemudian dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang sudah berisi 1 liter akuades. Selanjutnya dididihkan di atas hot plete dan dihomogenkan dengan
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menggunakan magnetic stirrer. Kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave selama 15 menit dengan susu 121
o
C di dalam Laminar Air Flow Himedia Laboratories, 2011.
6. Pembuatan Media MHA Mueller Hinton Agar
Pembuatan media MHA dilakukan untuk melakukan pengujian aktivitas antibakteri. Sebanyak 38 gram Mueller Hinton Agar kemudian dimasukkan ke
dalam labu erlenmeyer yang sudah berisi 1 liter akuades. Kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih dan dihomogenkan dengan menggunakan
magnetic stirrer. Selanjutnya dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121
o
C.Lalu media dituang ke dalam cawan petri sebanyak masing-masing ±10 mL di Laminar Air Flow dan biarkan sampai memadat
Conda Laboratories, 2014.
7. Pembuatan Media PDY Broth Potato Dextrose Yeast Broth
Media PDY digunakan untuk fermentasi kapang endofit. Sebanyak 24 gram Potato Dextrose Broth, 2 gram Yeast Extract dan 5 gram kalsium karbonat
CaCO
3
, ditambahkan dengan 1 liter akuades kemudian dipanaskan seperti perlakuan media sebelumnya hingga homogen. Penambahan kalsium karbonat
sedikit demi sedikit ke dalam larutan media tersebut hingga dicapai pH 6-7. Selanjutnya media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121
o
C selama 15 menit Ramadhan, 2011. Pada proses sterilisasi berlangsung suhu dan tekanan
tinggi akan memperbesar penetrasi uap air ke dalam sel-sel mikroba yang menyebabkan koagulasi protein-protein protoplasma dan mempercepat kematian
mikrobia, sehingga diharapkan didapatkan media yang steril, terbebas dari mikroorganisme lain.
3.5.2 Isolasi Kapang Endofit
Isolasi kapang endofit dilakukan secara triplo.
3.5.2.1 Sterilisasi Permukaan
Bagian daun tanaman Crinum asiaticum L yang masih segar dicuci dengan air mengalir selama 10 menit dan dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet LAFC
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
selanjutnya daun dipotong berukuran 1 x 1 cm
2
, direndam ke dalam etanol 70 selama 3 menit, kemudian dipindahkan ke dalam larutan NaOCl Sodium
Hipoklorit 5,25 selama 5 menit. Lalu dikeringkan dengan tisu steril dan terakhir dicuci dengan etanol 70 selama ± 30 detik diikuti dengan akuades
sterilselama 3 menit. Lalu potongan daun dikeringkan di atas kertas saring steril Ariyono, et.al., 2014 Wahyudi, 1998. Untuk mengisolasi kapang endofit dari
daun bakung ini potongan daun dibuat 2 bagian selanjutnya secara hati-hati potongan daun diletakkan secara berhadapan pada media isolasi PDA yang sudah
dipadatkan. Media PDA diinkubasi pada suhu ruang selama 14 hari. Proses sterilisasi hingga proses pengeringan semuanya harus dilakukan secara aseptis di
ruang Laminar Air Flow Cabinet Strobel, et.al., 2003.
3.5.2.2 Pemurnian Kapang Endofit
Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi kemudian dimurnikan ke dalam media PDA yang lain menggunakan metode cawan gores Spread Plate
untuk mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain. Proses ini dilakukan dengan cara isolat kapang yang telah murni dipindahkan ke dalam
media PDA yang lain dengan menggunakan jarum ose steril untuk digunakan sebagai kultur kerja working culture dan media agar miring PDA sebagai kultur
stok stock culture. Working culture kapang endofit diinkubasi pada suhu ruang 25
o
C selama 7-9 hari selanjutnya Stock culture diinkubasi pada suhu ruang selama 5-7 hari kemudian disimpan pada suhu 4
o
C dalam lemari pendingin Kumala dan Endro, 2007.
3.5.3 Karakterisasi Kapang Endofit
Karakterisasi kapang endofit dapat dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan kapang endofit secara makroskopis dengan melihat
morfologi koloni meliputi : warna dan struktur permukaan koloni, ada atau tidaknya tetes eksudat exudate drops, warna eksudat, diameter koloni, dan ada
atau tidaknya lingkaran konsentris zonasi. Pengamatan ini dilakukan dari awal penanaman hingga beberapa waktu tertentu dan mencatat semua perubahan yang
terjadi Gandjar, et.al., 1999.
Kategori