32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Untuk karakterisasi mikroskopis dilakukan dengan pembuatan preparat Slide culture methode. Terlebih dahulu cawan petri yang berisi tissue, kaca
objek dan kaca penutup dibungkus menggunakan kertas perkamen, selanjutnya cawan petri disterilkan pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi selesai, pada kaca objek ditetesi medium PDA steril, dibiarkan sampai
membeku Kemudian ambil sedikit miselium kapang endofit dengan menggunakan jarum ose setril, diletakkan pada media agar PDA yang diteteskan
pada kaca objek secara aseptis. Selanjutnya diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Setelah proses inkubasi selesai, kaca penutup dilepaskan, lalu 1 tetes etanol
96 dan 1 tetes Methylene blue kemudian ditutup kembali dengan menggunakan cover glass, ditunggu sampai mengering lalu kemudian diamati di bawah
mikroskop pada perbesaran 100 kali, 200 kali, dan 400 kali. Pengamatan yang dilakukan meliputi ada atau tidaknya sekat pada hifa, pertumbuhan hifa, bentuk
dan warna konidia Atlas, et al,. 2006; Ramadhan, 2011.
3.5.4 Kurva Pertumbuhan Kapang Kapang
sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut antara
lain adalah karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Kekurangan atau tidak adanya sumber-sumber nutrisi ini dapat
mempengaruhi pertumbuhan suatu mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan
kematian Anonymous, 2006. Sebelum biakan kapang endofit melalui proses fermentasi, terlebih dahulu
dilakukan pengukuran kurva pertumbuhan, hal ini dilakukan untuk mengetahui kapan kapang endofit harus dipanen atau kapan kapang endofit tersebut
menghasilkan sel dan metabolit sekunder paling banyak Wuryanti, 2008. Pembuatan kurva kapang dengan menggunakan medium Potato Dextrose Yeast
PDY, biakan kapang diinkubasi pada medium selama 21 hari dengan cara statis. Sebanyak 1-2 mL medium dicuplik setiap 48 jam sekali dan diukur nilai absorban
dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm.
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.5.5 Fermentasi
Istilah fermentation berasal dari bahasa Latin Fevere yang berarti mendidih. Penampakan mendidih tersebut disebabkan produksi gas CO
2
karena aktivitas katabolisme anaerob dari mikroba pada gula-gula di dalam ekstrak
Stanburry, et,al., 1995. Fermentasi dilakukan bertujuan untuk memperoleh sel kapang endofit dalam jumlah yang banyak sehingga senyawa metabolit yang
dihasilkan dapat optimal Ramadhan, 2011. Proses ini dilakukan pada saat koloni berumur 2-3 minggu, koloni kapang endofit murni diambil sebanyak 3 bulatan
kira-kira 1x1 cm
2
terdiri dari hifa dan medium agar kemudian diinokulasikan ke dalam wadah botol bening yang telah berisi 250 mL media PDY. Selanjutnya
diinkubasi selama 21 hari pada suhu ruangan dalam kondisi statis Rahmawati, 2006 dan Phongpaichit et al., 2006 dengan modifikasi.
3.5.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Ekstraksi dilakukan dengan cara pertama dipisahkan antara medium fermentasi dan biomassa. Selanjutnya medium fermentasi dilakukan filtrasi
menggunakan corong yang telah dilapisi kapas dan diikuti penyaringan menggunakan kertas saring. Filtrat jernih dilakukan dengan cara partisi
menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan volume medium dan pelarut adalah 1:1. Sementara biomassa dihaluskan terlebih dahulu
menggunakan lumpang dan alu steril. Kemudian dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan metanol selama 24 jam dengan tujuan untuk
menarik semua komponen senyawa yang terkandung di dalamnya. Setelah itu, dilakukan filtrasi hingga terdapat filtrat jernih Yulia, 2004 dengan modifikasi.
Dari semua filtrat yang didapat satu per satu dilakukan partisi. Pertama, filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan n-heksan dengan
volume yang sama lalu dihomogenkan dengan cara digojok dan sesekali penutup kran dibuka untuk mengeluarkan udara, lalu didiamkan sampai terjadi pemisahan
atau terbentuk dua lapisan fase cair. Lapisan n-heksan dikeluarkan dan ditampung dalam wadah yang lain. Pada lapisan air ditambahkan etil asetat dengan volume
yang sama, selanjutnya dihomogenkan lalu didiamkan sampai terjadi pemisahan sempurna. Lapisan etil asetat diambil dan ditampung ke dalam wadah botol lain.
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sehingga didapatkan ekstrak n-heksan En, ekstrak etil asetat Ee, dan ekstrak metanol Em. Setelah itu ekstrak yang sudah didapat diuapkan menggunakan
Vaccum Rotary Evaporator untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian dimasukkan ke dalam vial yang sebelumnya telah ditimbang untuk
dijadikan sebagai ekstrak uji.
3.5.7 Peremajaan Bakteri Uji
Peremajaan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa diinokulasi sebanyak satu ose ke media agar
NA miring yang selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35
o
C selama 18 - 24 jam
Radji, 2006.
3.5.8 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Pembuatan suspensi bakteri uji dilakukan dengan cara masing-masing bakteri hasil peremajaan dibuat menjadi suspensi mikroba 10
9
sesuai dengan kekeruhan Mc Farland III dengan cara satu ose biakan bakteri, dimasukkan secara
aseptis ke dalam tabung reaksi yang telah diisi larutan NaCl 0,9 kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Kekeruhan suspensi bakteri yang
dibuat dibandingkan dengan kekeruhan standar Mc Farland III. Apabila kekeruhan belum sama, biakan bakteri diinokulasi kembali ke dalam suspensi
yang dibuat sehingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar Radji, 2006.
Suspensi bakteri 10
9
yang sudah dibuat kemudian diencerkan sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
6
, pengenceran dilakukan dengan cara suspensi bakteri 10
9
dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi yang telah diisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
8
. Suspensi bakteri 10
8
dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi
bakteri uji 10
7
. Suspensi bakteri 10
7
dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
6
Radji, 2006 dan Bobby, 2013 dengan modifikasi.
