49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gelombang 600 nm. Metode ini sangat cocok apabila suspensi biakan berbentuk cair dan homogen serta sel yang densitasnya tinggi Fardiaz, 1992.
Hasil pengukuran pertumbuhan kapang endofit digunakan sebagai dasar atau gambaran untuk proses fermentasi yang akan dilakukan. Hal ini dilakukan
untuk mengetahui waktu yang optimal berapa lama proses fermentasi berlangsung. Menurut Kuswardani dan Wijajaseputra 1998, waktu pembiakan
yang terlalu singkat akan menghasilkan Protein Sel Tunggal PST dalam jumlah rendah karena biokonversi komponen medium belum optimal. Sedangkan waktu
pembiakan yang terlalu lama akan menyebabkan terjadinya penurunan protein yang terakumulasi dalam PST akibat autobiodegradasi untuk memenuhi
kebutuhan energinya sehubungan dengan ketersediaan nutrien dalam medium yang semakin tidak mencukupi. Namun pada penelitian ini waktu yang digunakan
selama fermentasi yaitu 21 hari untuk semua isolat. Oleh karena itu perlu adanya optimasi waktu fermentasi mengingat hal ini merupakan faktor yang sangat
penting terhadap metabolit ataupun senyawa aktif yang didapatkan.
4.5 Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit
4.5.1 Fermentasi
Proses fermentasi yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan medium PDY Potato Dextrose Yeast yang diproses semi sintetik dengan cara
membuat ekstrak kentang terlebih dahulu lalu kemudian dengan menambahkan Dextrose dan Yeast Extract sebagai nutrisi. Setelah media terbentuk, dicuplik
sebanyak ± 1 mL untuk mengukur pH medium. Pengukuran pH dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui keasaman dari medium fermentasi. Hal ini disebabkan
karena pH medium dapat mempengaruhi fungsi membran sel, morfologi dan struktur sel serta produksi biosintesia kapang. Kapang akan tumbuh dan
berkembang biak dengan baik pada pH yang optimum yaitu, 6,7 ± 0,2. Pada kondisi ini, merupakan pH yang optimal bagi kapang dalam memproduksi
metabolit sekunder Gandjar et al., 2006. Pengukuran dilakukan menggunakan pH meter dan penambahan CaCO
3
untuk mengatur keasaman medium. Setelah itu medium dimasukkan ke dalam botol kaca sebagai fermentor. Sebanyak 250 mL
medium dimasukkan ke dalam masing-masing botol lalu kemudian dilakukan
50
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121
o
C selama 15 menit. Selanjutnya, kapang hasil biakan yang terbebas dari kontaminan dan sudah
berusia 14 hari dimasukkan secara aseptis ke dalam medium PDY steril. Biakan kapang terlebih dahulu dibuat sumuran menggunakan sedotan steril berdiameter 7
mm. Sebanyak 4 empat bulatan kapang secara aseptis dimasukkan ke dalam medium PDY. Gambar proses fermentasi dapat dilihat pada Lampiran 13 halaman
80. Proses fermentasi dilakukan selama 21 hari dengan dengan metode statis
pada suhu ruang. Dengan metode seperti ini, pertumbuhan kapang akan terlihat jelas di atas permukaan medium seperti pertumbuhan miselium atau biomassa sel
yang semakin lama semakin tebal. Selain itu, juga terlihat hifa vegetatif yang tumbuh ke bagian dalam medium seperti akar yang bercabang atau bahkan terlihat
seperti gumpalan kapas. Medium fermentasi juga mengalami perubahan dilihat dari perubahan warna yang semula sedikit keruh menjadi semakin bening, ada
juga yang berubah menjadi merah dan juga terjadi perubahan menjadi lebih keruh dari sebelumnya dan hal ini bisa saja terjadi. Menurut Gandjar, et al. 2006, hal
tersebut dapat terjadi karena kapang endofit masing-masing memiliki bentuk morfologi dan waktu pertumbuhan yang berbeda.
4.5.2 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Setelah proses fermentasi selesai, langsung proses ekstraksi dilakukan yaitu pertama pemisahan antara medium cair dan biomassa. Selanjutnya medium
cair dilakukan filtrasi menggunakan corong yang telah dilapisi kapas dan diikuti penyaringan menggunakan kertas saring. Tujuan dilakukannya filtrasi ini adalah
untuk mendapatkan filtrat jernih. Karena medium fermentasi ini menggunakan aquadest sehingga cara yang digunakan untuk memisahkan komponen senyawa
adalah dengan partisi cair-cair. Dari sejumlah isolat yang didapat pada proses evaporasi, isolat DP.1A.1
fraksi n-heksan tidak ada yang tertinggal dalam wadah penampung ekstrak sehingga tidak dapat dilakukan penimbangan bobot ekstrak, demikian halnya
dengan tahap uji aktivitas tidak dapat dilakukan. Hal ini dapat terjadi disebabkan
51
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
karena komponen senyawa di dalam ekstrak tidak ada yang tertarik ke dalam n- heksan. Tabel 4.4 di bawah ini menunjukkan jumlah perolehan bobot ekstrak
isolat kapang endofit.
Tabel 4.4. Perolehan Bobot Ekstrak Isolat Kapang Endofit
Isolat Kapang Endofit
Fraksi Metanol mg
Fraksi n-heksan mg
Fraksi etil asetat mg
DP.1A.1 662
230 DP.1A.2
1076 44
124 DU.2B.1
832 39
125 DU.2B.2
1186 32
99 DU.3B.2
1019 41
104
4.6 Karakterisasi Bakteri Uji
Karakterisasi terhadap bakteri uji dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kemurnian bakteri yang akan digunakan apakah masih murni dan
masih layak digunakan atau bahkan sudah mengalami kerusakan. Identifikasi dapat dilakukan secara makroskopik maupun mikroskopik. Sebelum proses
identifikasi dilakukan, bakteri uji dibiakkan terlebih dahulu pada medium NA Nutrient Agar selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Pada penelitian ini menggunakan empat bakteri uji yang bersifat patogen
atau yang dapat menyebabkan penyakit. Selain itu, dari empat bakteri yang digunakan mewakili bakteri Gram positif Staphylococcus aureus ATCC 25923
dan Bacillus subtilis ATCC 6633 dan bakteri Gram negatif Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Karakterisasi bakteri uji dapat dilakukan secara makroskopik yaitu dengan mengamati warna dan bentuk koloni, diameter koloni, dan permukaan pinggiran
koloni. Sementara identifikais bakteri secara mikroskopik dilakukan dengan cara pewarnaan Gram. Tujuan dari pewarnaan ini yaitu untuk membedakan bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif. Menurut Atika, 2007, setelah pewarnaan dilakukan, bakteri akan berwarna ungu untuk bakteri Gram positif dan akan
berwarna merah untuk bakteri Gram negatif.
