34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sehingga didapatkan ekstrak n-heksan En, ekstrak etil asetat Ee, dan ekstrak metanol Em. Setelah itu ekstrak yang sudah didapat diuapkan menggunakan
Vaccum Rotary Evaporator untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian dimasukkan ke dalam vial yang sebelumnya telah ditimbang untuk
dijadikan sebagai ekstrak uji.
3.5.7 Peremajaan Bakteri Uji
Peremajaan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa diinokulasi sebanyak satu ose ke media agar
NA miring yang selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35
o
C selama 18 - 24 jam
Radji, 2006.
3.5.8 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Pembuatan suspensi bakteri uji dilakukan dengan cara masing-masing bakteri hasil peremajaan dibuat menjadi suspensi mikroba 10
9
sesuai dengan kekeruhan Mc Farland III dengan cara satu ose biakan bakteri, dimasukkan secara
aseptis ke dalam tabung reaksi yang telah diisi larutan NaCl 0,9 kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Kekeruhan suspensi bakteri yang
dibuat dibandingkan dengan kekeruhan standar Mc Farland III. Apabila kekeruhan belum sama, biakan bakteri diinokulasi kembali ke dalam suspensi
yang dibuat sehingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar Radji, 2006.
Suspensi bakteri 10
9
yang sudah dibuat kemudian diencerkan sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
6
, pengenceran dilakukan dengan cara suspensi bakteri 10
9
dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi yang telah diisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
8
. Suspensi bakteri 10
8
dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi
bakteri uji 10
7
. Suspensi bakteri 10
7
dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl 0,9 sehingga diperoleh suspensi bakteri 10
6
Radji, 2006 dan Bobby, 2013 dengan modifikasi.
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.5.9 Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara In Vitro dengan metode difusi cakram Disc Diffusion. Sebanyak 1 mL suspensi bakteri 10
6
diambil menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Medium
MHA Mueller Hinton Agar dalam bentuk cair dituangkan ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri. Cawan petri digoyang secara merata agar suspensi
bakteri dan medium dapat tercampur homogen dan dibiarkan sampai medium memadat. Semua proses dilakukan secara aseptis di dalam LAF Laminar Air
Flow. Setiap ekstrak uji Eh, Ee dan Em masing-masing dibuat dengan konsentrasi 1000 ppm. Selanjutnya sebanyak 20 µL ekstrak uji diserapkan pada
kertas cakram kosong steril. Semua kertas cakram yang sudah mengandung ekstrak uji diletakkan pada permukaan media uji MHA yang sudah dipadatkan
lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. Antibakteri yang digunakan sebagai kontrol positif yaitu Kloramfenikol
pada kertas cakram dengan konsentrasi 30 µgcakram. Selanjutnya kertas cakram diletakkan pada permukaan media uji lalu didiinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. Area jernih atau zona bening mengindikasikan adanya hambatan
pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar Pratiwi, 2008 dengan modifikasi. Suatu senyawa dapat dinyatakan berpotensi
sebagai antibakteri apabila dengan konsentrasi maksimum 1000 ppm mampumenghasilkan zona hambat minimum 8 mm Surain dan Aneja, 2014.
Aktivitas antibakteri ditandai dengan adanya zona hambat atau zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram yang mengandung ekstrak. Diameter zona
hambat yang terbentuk diukur menggunakan jangka sorong.
