Identifikasi triterpenoid dan steroid

Uji identifikasi senyawa dalam ekstrak n-heksana daun binahong menunjukkan hasil positif hanya pada uji steroid. Uji identifikasi dengan uji warna ini sangat memiliki kekurangan. Dimana dalam uji ini, tidak bisa untuk menganalisis golongan senyawa dalam ekstrak dengan kadar yang kecil, karena perubahan yang sangat kecil sulit dilihat secara visual. Oleh karena itu, akan dilakukan identifikasi yang lebih lanjut dengan proses elusidasi struktur.

E. Isolasi dengan Kromatografi Kolom

Proses elusidasi struktur membutuhkan sampel dengan kandungan senyawa murni. Oleh karena di dalam ekstrak masih terdapat bermacam-macam senyawa harus terlebih dahulu dimurnikan atau dipisahkan dari senyawa lain. Pemurnian senyawa ini dapat dilakukan dengan cara kromatografi. Ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini merupakan ekstrak dengan pelarut n-heksana, maka senyawa-senyawa yang terkandung didalamnya merupakan senyawa lipofil non-polar. Oleh karena itu, pemilihan kromatografi kolom dalam awal proses isolasi merujuk pada Székely cit., Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995, dimana krombinasi yang dapat dilakukan dalam mengisolasi senyawa lipofil, salah satunya dengan menggunakan kromatografi cair dan kromatografi padat, misalnya menggunakan kombinasi kolom terbuka yang dilanjutkan dengan KLT preparatif. Selain itu, pemilihan kromatografi kolom karena dapat digunakan dengan volume sampel yang cukup besar. Dalam proses ini, tidak diberikan tekanan untuk mempercepat aliran fase gerak agar pemisahan dapat lebih dimaksimalkan. Kromatografi kolom dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam ekstrak yang merupakan campuran banyak senyawa. Pemisahan ini bertujuan untuk mendapatkan fraksi, atau dengan kata lain, masih terdapat senyawa lain dalam eluat yang tertampung.

1. Optimasi fase gerak kromatografi kolom dengan metode pendekatan KLT

Menurut Gritter, Bobbit, dan Schwarting 1991, pemilihan fase gerak untuk melakukan proses kromatografi kolom dapat dilakukan dengan 3 pendekatan, yaitu dengan penelusuran pustaka, pendekatan dengan kromatografi lapis tipis, serta menggunakan elusi landaian umum mulai dari pelarut non-polar hingga pelarut polar. Penelusuran pustaka sangat sulit dilakukan karena belum diketahuinya senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana daun binahong yang akan dipisahkan, sedangkan menggunakan elusi landaian umum, menggunakan fase gerak yang banyak dan cukup rumit untuk dilakukan karena menggunakan campuran pelarut yang diubah kepolarannya secara bertahap dan kontinyu. Oleh karena itu pendekatan dengan kromatografi lapis tipis KLT merupakan pendekatan yang paling mudah dan efisien dalam mengoptimasi fase gerak yang akan digunakan dalam proses kromatografi kolom. Oleh karena akan digunakan silika gel sebagai fase diam dalam kromatografi kolom, sistem kromatografi ini merupakan fase normal. Fase normal berarti bahwa fase diam yang digunakan adalah polar, dan fase gerak yang digunakan adalah non-polar. Sistem kromatografi fase normal inilah yang juga digunakan dalam KLT untuk menentukan sistem terbaik dalam kromatografi kolom, sehingga fase diam yang digunakan dalam KLT juga silika gel. Untuk mendapatkan eluen yang ideal, dilakukan percobaan sederhana, yakni dengan mengelusi ekstrak n-heksana pada kromatografi lapis tipis dengan sejumlah pelarut yang berbeda kepolarannya. Pada proses ini optimasi ini, ekstrak n-heksana pekat ditotolkan pada pelat silika yang telah dibuat dengan ketebalan silika 0,25 mm dan diaktifkan sebelumnya selama kurang lebih 1 jam. Penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler. Totolan yang dihasilkan tidak boleh melebar, karena akan menurunkan kualitas pemisahan. Pelat yang telah ditotolkan dengan ekstrak dimasukan dalan chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak masing- masing, untuk dikembangkan. Tabel VII. Kepolaran fase gerak yang digunakan Garrett,1998 Fase Gerak Kepolaran n-heksana 0,1 Acetonitril 5,8 Kloroform 4,1 Kloroform:Metanol 1:1 4,8 Metanol 5,1 Setelah pengembangan telah mencapai 10 cm dari totolan awal, pelat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Kemudian diamati profil kromatogram ekstrak yang terbentuk pada tiap fase gerak yang berbeda. Gambar 23. Hasil KLT ekstrak dengan fase gerak a n-heksana, b asetonitril, c kloroform, e metanol:kloroform 1:1. Tabel VIII. Hasil KLT ekstrak dengan berbagai fase gerak Gambar No. bercak Nilai Rf Warna 23 a 1 0,06 Hijau kehitaman 2 0,17 Kuning 3 0,35 Kuning 23 b 1 0,04 Hijau kehitaman 2 0,38 Kuning kehijauan 23 c 1 Hijau kehitaman 2 0,05 Hijau tua 3 0,3 Hijau 4 0,35 Kuning 5 0,45 Hijau 6 0,66 Hijau tua 7 0,74 Hijau 8 0,85 Kuning 23 d 1 Hijau kehitaman 2 0,22 Kuning muda 3 0,37 Hijau tua 4 0,46 Hijau kehitaman 5 0,51 Kuning 23 e 1 Hijau tua 2 0,26 Hijau kehitaman 3 0,34 Kuning Dari hasil kromatogram, didapatkan bahwa kromatogram ekstrak dengan eluen n-heksana menghasilkan 2 bercak yang terpisah dimana bercak 1 dan 3 mengekor. Kromatogram dengan eluen asetonitril menghasilkan 2 bercak yang tidak memisah dimana bercak 2 mengekor. Kromatogram dengan eluen kloroform menghasilkan 8 bercak yang terpisah dengan baik, kecuali bercak 2 yang mengekor. Kromatogram dengan eluen kloroform:metanol 1:1 menghasilkan 5 bercak yang tidak memisah serta mengekor. Kromatogram dengan eluen metanol menghasilkan 3 bercak yang tidak memisah dan mengekor.