Kemudian plat disemprot dengan reagen Liebermann Burchard dan H
2
SO
4
- metanol 1:1.
4. Fraksinasi Ekstrak N-Heksana Daun Binahong dengan Kromatografi Kolom KK
Untuk mengisolasi dari ekstrak dengan menggunakan metode kromatografi kolom KK, maka perlu dilakukan optimasi fase gerak dengan
menggunakan KLT terlebih dahulu. a. Optimasi fase gerak dengan kromatografi lapis tipis KLT
Untuk membuat plat KLT, sebanyak 7 g adsorben silika gel yang akan digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan 21 mL pelarut aquadest. Bubur
yang telah ada kemudian diratakan pada plat kaca dengan ukuran 5 x 15cm dengan menggunakan alat TLC Plate Coater, dengan ketebalan 0,25 mm. Setelah
adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 120
o
C selama paling kurang satu jam. Ekstrak kental n-heksana daun binahong ditotolkan pada plat KLT yang
telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan menggunakan 5 larutan pengembang berupa asetonitril, n-heksana, kloroform, kloroform:metanol 1:1,
dan metanol. Dari hasil elusi dilihat fase gerak mana yang menghasilkan pemisahan
terbaik. Fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik kemudian digunakan sebagai fase gerak pada kromatografi kolom.
b. Kromatografi kolom Pada proses KK, preparasi kolom dilakukan dengan membuat suspensi
silica gel G dalam kloroform kemudian dimasukan kedalam kolom dengan tinggi silica gel adalam 20 cm pada kolom 1,8 x 30 cm. penuangan suspensi silika
dilakukan dengan hati-hati dan meminimalisir timbulnya gelembung udara maupun aliran turbulen, serta dijaga agar silika dalam kolom tidak kering dengan
menjaga aliran eluen yang kontinyu. Untuk itu, pada bagian atas kolom dihubungkan dengan corong pisah yang berisi eluen kloroform.
Sebanyak 0,5 mL ekstrak dimasukan ke dalam kolom, lalu eluen dialirkan secara kontinyu ke dalam kolom, sehingga ekstrak yang berupa
campuran dapat terpisah menjadi beberapa bagian. Eluat yang keluar ditampung setiap 3 menit.
c. Analisis Kualitatif eluat dengan KLT Masing-masing eluat ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam
chamber yang telah dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak kloroform, kloroform : metanol 1:1, dan metanol.
Isolat dinyatakan murni apabila hanya terdapat satu bercak. Jika terdapat lebih dari satu bercak, proses kormatografi lapis tipis dapat dilakukan pada eluat
yang dihasilkan. d. Uji Fitokimia Tiap Fraksi
Eluat yang memiliki profil kromatogram yang sama dikumpulkan. Sehingga mendapatkan 4 fraksi. Tiap fraksi kemudian diuapkan dengan vacuum
rotary evaporator untuk mendapatkan fraksi kental.
Kategori