22
E. Kromatografi Lapis Tipis KLT
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia. Dimana campuran yang akan dipisahkan ditotolkan berupa bercak atau pita. Pemisahan terjadi
dalam bejana tertutup rapat yang berisi fase gerak, dan pemisahan terjadi selama perambatan kapiler Stahl, 1985. KLT merupakan salah satu metode kromatografi
yang paling sederhana yang dapat memisahkan senyawa yang amat berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik, dan
bahkan ion anorganik, dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dengan biaya yang cukup rendah Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991.
Bila KLT dibandingkan dengan kromatografi kertas, KLT memiliki kelebihan yaitu keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan
disebabkan banyaknya jenis fase diam yang dapat digunakan selulosa atau silika gel, dan sebagainya. Kecepatan KLT yang lebih besar karena sifat penyerap yang lebih
padat dan merupakan keuntungan untuk menelaah senyawa yang kurang stabil. Kepekaan KLT karena jumlah yang diperlukan hanya berjumlah dalam µg Harborne,
1984.
Gambar 5. Proses kromatografi lapis tipis Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991
23
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai
untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi Gritter, Bobbit, dan
Schwarting, 1991. Lapisan buatan sendiri mempunyai beberapa kekurangan dan biasanya
memerlukan peralatan tertentu untuk membuatnya Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Untuk membuat pelat KLT, terlebih dahulu pelat kaca dibersihkan dengan
aseton untuk membersihkan lemak. Kemudian bubur silika harus di kocok kuat dalam waktu yang cukup 90 detik sebelum penyaputan. Setelah itu, pelat dikeringkan pada
suhu kamar, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 100-110°C selama 30 menit Harborne, 1984
Umumnya jumlah sampel yang ditotolkan sekitar 50-100 µg setiap bercak untuk kromatografi adsorbsi. Untuk meningkatkan konsentrasi sampel pada bercak,
dapat dilakukan penotolan berulang Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Pada pengembangan lapisan KLT, terdapat 3 gerakan pelarut. Pertama
pelarut bergerak ke atas melalui lapisan. Kedua, uap pelarut akan terjerap oleh lapisan di atas garis depan gerakan pertama pelarut. Ketiga, penguapan pelarut dibawah garis
depan pada lapisan. Sehingga untuk meminimalkan banyaknya gerakan pelarut, maka dibutuhkan penjenuhan bejana. Penjenuhan bejana dapat dilakukan dengan melapisi
dinding bejana dengan kertas saring. Kertas harus dibasahkan dengan pelarut, dan bejana yang tertutup harus dibiarkan sebentar sebelum lapisan fase diam diletakkan di
24
dalam bejana Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Biasanya KLT dilakukan dengan pengembangan naik dalam suatu bejana yang dindingnya dilapisi dengan
kertas saring sehingga bejana jenuh dengan pengembang yang digunakan Harborne, 1984
Pemisahan pada kromatografi planar misalnya kromatografi lapis tipis pada umumnya akan dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh
permukaan fase diam. Analit dicirikan dengan faktor retardasi R
f
atau jarak migrasi analit terhadap jarak ujung fase geraknya. Rohman, 2009
R
f
= Rohman, 2009 ………………………..1
Cara penampakan bercak yang tidak merusak dapat digunakan untuk KLT preparatif dan kuantitatif. Cara khas merupakan cara yang umumnya digunakan
dengan menyemprot pelat dengan pereaksi yang akan menimbulkan warna jika bereaksi dengan bercak cuplikan. Ada dua segi penting mengenai penggunaan
pereaksi semprot. Segi pertama ialah mengenai informasi gugus fungsi yang dapat diperoleh. Serta segi kedua yaitu mengenai derajat warna yang kecil yang terjadi jika
pereaksi semprot ini dipakai Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991.
F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLTP
Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling murah dan menggunakan peralatan yang paling sederhana adalah kromatografi lapis tipis
preparatif KLTP Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995. KLTP adalah
25
cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan kecil 50 mg sampai 1 g dari senyawa yang kurang atsiri. Pada KLTP, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa
garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita
ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tidak berwarna, dan fase diam, yang mengandung pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan
diekstraksi dari fase diam dengan pelarut polar Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991.
Fase diam yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun hidrofil. Seperti biasa, silika gel lebih
banyak digunakan daripada fase diam lain. Ketebalan optimum untuk lapisan preparatif sekitar 1-1,5 mm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat akan
mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Pada umumnya, suspensi yang dipakai untuk mencetak lapisan preparatif agak lebih kental daripada
yang dipakai untuk lapisan tipis. Lapisan harus dibiarkan mengering selama beberapa jam pada suhu kamar sebelum diaktifkan. Ini akan mencegah peretakan dan
pengerasan pada bagian luar. Pengaktifan dilakukan pada suhu 100°C, sekurang- kurangnya selama 1 jam Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991.
Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, karena jika pelarut
kurang mudah menguap maka dapat terjadi pelebaran pita. Pemilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena
26
ukuran partikel penyerap sama, maka pelarut yang dipakai pada KLT analitik dapat dipakai langsung pada KLTP Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995.
Pelarut yang memiliki titik didih di antara 50-90°C cocok untuk pelarut cuplikan. Pada penotolan dilakukan penyebaran larutan cuplikan yang volumenya agak besar
sampai 2 ml berbentuk pita seragam tipis lebar 1 sampai 5 mm tanpa mengganggu permukaan lapisan secara berlebihan Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991.
Pengembangan pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa pelat sekaligus. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut
pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tercelup di dalam pengembang. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan
berulang. Jika pemisahan secara KLTP telah dicapai, pelat dikeringkan kemudian dimasukkan lagi ke dalam bejana Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995.
Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan dengan pengumpul vakum.
Senyawa harus diekstraksi dari penyerap dengan pelarut yang paling kurang polar yang mungkin sekitar 5 ml untuk 1 g penyerap. Semakin lama senyawa kontak
dengan penyerap, semakin besar kemungkinana penguraian. Ekstrak disaring melalui kaca berpori 4 dan kemudian melalui membrane 0,2-0,45 µm. Kemudian pelarut
diuapkan dan komponen diisolasi Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995.
Kategori