Terpenoid Metabolit Sekunder pada Tanaman 1. Senyawa fenolik

20 Ukuran partikel fase diam untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Untuk kolom yang dijalankan dengan gaya tarik bumi biasanya 63-250 µm. sedangkan kolom yang dijalankan dengan tekanan mengandung partikel fase diam dengan ukuran 40-63 µm. Silika gel SiO 2 atau asam silikat merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena dapat dipakai dengan semua pelarut Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Fase diam dapat dikemas ke dalam tabung dengan cara basah maupun kering. Umumnya cara basah lebih mudah dan lebih sering dipakai untuk silika gel. Sedangkan cara kering lebih baik untuk alumina. Pada cara basah, fase diam dimasukkan ke dalam kolom, dan tabung diisi sepertiganya dengan pelarut. Pelarut yang dipakai pada proses pengemasan ini mungkin sama dengan fase gerak atau pelarut lain yang kepolarannya lebih rendah. Fase diam dibuat suspensi dengan pelarut, dan suspensi ini dituangkan ke dalam pelarut yang ada di tabung. Selama proses pengendapan, tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahan agar dapat diperoleh lapisan yang seragam Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991 Pendekatan untuk memilih fase gerak ada tiga. Pertama dengan penelusuran pustaka, karena sebagian besar senyawa pada kimia analitik, biokimia, dan kimia obat diketahui dan pernah dikromatografi. Ketika senyawa belum diketahui atau senyawa yang tidak biasa, maka dapat dicari informasi mengenai senyawa yang ukuran serupa dan memiliki gugus fungsi yang sama. Kedua adalah hubungan dengan KLT. Karena KLT membutuhkan waktu yang singkat dengan menggunakan pelarut fase gerak yang sesedikit mungkin, maka agak mudah untuk dapat menentukan kondisi untuk 21 pemisahan memakai kolom. Ketiga adalah dengan pemakai elusi landaian umum mulai dari pelarut yang tidak menggerakan sampel sampai pelarut yang lebih polar yang menggerakan sampel Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Sampel dilarutkan dalam sedikit pelarut, ditambahkan ke bagian atas kolom dan dibiarkan mengalir ke bagian atas fase diam. Kemudian kromatogram dikembangkan. Pada pengembangan ini, sampel yang berupa campuran akan terpisah. Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991 Kecepatan migrasi tiap senyawa melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan distribusinya D yang ditentukan oleh afinitas relatif senyawa itu pada kedua fase. Nilai D koefisien distribusi didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi senyawa dalam fase diam dibanding dengan konsentrasi senyawa tersebut dalam fase gerak. Semakin besar nilai D, maka migrasi senyawa semakin lambat, dan semakin kecil nilai D, migrasinya akan semakin cepat. Semakin besar perbedaan distribusi antar senyawa, maka campuran akan semakin mudah terpisah. Rohman, 2009. Secara umum pemantauan senyawa yang telah dipisahkan dilakukan dengan membagi eluat menjadi beberapa fraksi. Fraksi dianalisis dengan menggunakan KLT maupun KCKT sehingga hasilnya dapat digunakan sebagai petunjuk fraksi mana yang harus digabung untuk mengisolasi produk. Sedangkan untuk isolasi produk, fraksi kolom yang telah digabungkan atau mengandung senyawa yang sama, fase geraknya diuapkan dengan tekanan rendah Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. 22

E. Kromatografi Lapis Tipis KLT

Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia. Dimana campuran yang akan dipisahkan ditotolkan berupa bercak atau pita. Pemisahan terjadi dalam bejana tertutup rapat yang berisi fase gerak, dan pemisahan terjadi selama perambatan kapiler Stahl, 1985. KLT merupakan salah satu metode kromatografi yang paling sederhana yang dapat memisahkan senyawa yang amat berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik, dan bahkan ion anorganik, dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dengan biaya yang cukup rendah Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Bila KLT dibandingkan dengan kromatografi kertas, KLT memiliki kelebihan yaitu keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan disebabkan banyaknya jenis fase diam yang dapat digunakan selulosa atau silika gel, dan sebagainya. Kecepatan KLT yang lebih besar karena sifat penyerap yang lebih padat dan merupakan keuntungan untuk menelaah senyawa yang kurang stabil. Kepekaan KLT karena jumlah yang diperlukan hanya berjumlah dalam µg Harborne, 1984. Gambar 5. Proses kromatografi lapis tipis Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991