b. Kromatografi kolom Pada proses KK, preparasi kolom dilakukan dengan membuat suspensi
silica gel G dalam kloroform kemudian dimasukan kedalam kolom dengan tinggi silica gel adalam 20 cm pada kolom 1,8 x 30 cm. penuangan suspensi silika
dilakukan dengan hati-hati dan meminimalisir timbulnya gelembung udara maupun aliran turbulen, serta dijaga agar silika dalam kolom tidak kering dengan
menjaga aliran eluen yang kontinyu. Untuk itu, pada bagian atas kolom dihubungkan dengan corong pisah yang berisi eluen kloroform.
Sebanyak 0,5 mL ekstrak dimasukan ke dalam kolom, lalu eluen dialirkan secara kontinyu ke dalam kolom, sehingga ekstrak yang berupa
campuran dapat terpisah menjadi beberapa bagian. Eluat yang keluar ditampung setiap 3 menit.
c. Analisis Kualitatif eluat dengan KLT Masing-masing eluat ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam
chamber yang telah dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak kloroform, kloroform : metanol 1:1, dan metanol.
Isolat dinyatakan murni apabila hanya terdapat satu bercak. Jika terdapat lebih dari satu bercak, proses kormatografi lapis tipis dapat dilakukan pada eluat
yang dihasilkan. d. Uji Fitokimia Tiap Fraksi
Eluat yang memiliki profil kromatogram yang sama dikumpulkan. Sehingga mendapatkan 4 fraksi. Tiap fraksi kemudian diuapkan dengan vacuum
rotary evaporator untuk mendapatkan fraksi kental.
Tiap fraksi ditotolkan pada plat KLT 5 x 15 cm, dan dielusi dengan tiga fase gerak yaitu kloroform, kloroform : metanol 1:1, dan metanol. Kemudian
dari hasil elusi, plat disemprot dengan reagen Liebermann-Burchard. Fraksi yang digunakan merupakan fraksi yang memberikan hasil positif
terhadap reaksi Liebermann-Burchard, atau dengan kata lain, mengandung triterpenoid atau steroid.
5. Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLTP
a. Optimasi fase gerak untuk KLTP Untuk membuat plat KLT, sebanyak 7 g adsorben silika gel yang akan
digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan 21 mL pelarut akuades. Bubur yang telah ada kemudian diratakan pada plat kaca dengan ukuran 5x15cm dengan
menggunakan alat TLC Plate Coater, dengan ketebalan 0,25 mm. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk dikeringkan dalam
oven pada suhu 100 – 120
o
C selama paling kurang satu jam. Fraksi kental yang mengandung steroid atau triterpen, ditotolkan pada
plat KLT yang telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan menggunakan 3 larutan pengembang berupa kloroform, kloroform:metanol 1:1, dan metanol.
Dari hasil elusi dilihat fase gerak mana yang menghasilkan pemisahan terbaik. Fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik kemudian digunakan
sebagai fase gerak pada kromatografi lapis tipis preparatif. b. Tahap KLTP
Sebanyak 7 g adsorben silika gel yang akan digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan 21 mL pelarut akuades. Bubur yang telah ada kemudian
diratakan pada plat kaca dengan ukuran 20 x 20cm dengan menggunakan alat TLC Plate Coater, dengan ketebalan 0,5 mm. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat
lapis tipis yang terbentuk dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 120
o
C selama 1 jam.
Fraksi hasil isolasi dengan kromatografi kolom kemudian ditotolkan berupa pita pada plat KLT yang telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan
menggunakan larutan pengembang berupa kloroform, yaitu hasil optimasi sebelumnya.
Hasil elusi kemudian dikeringkan dan bercak yang pada pengujian sebelumnya positif terhadap Liebermann Burchard, dikerok dengan menggunakan
spatula kemudian ditampung dan diekstraksi dengan menggunakan pelarut kloroform. Hasil ekstraksi lalu dipekatkan dengan menggunakan rotary vaccum
evaporator. c. Analisis Kualitatif Isolat dengan KLT
Masing-masing eluat ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak kloroform,
kloroform : metanol 1:1, dan metanol. Isolat dinyatakan murni apabila hanya terdapat satu bercak. Jika terdapat
lebih dari satu bercak, proses kormatografi lapis tipis dapat dilakukan pada eluat yang dihasilkan. Jika dari hasil elusi telah diperoleh senyawa yang murni secara
KLT maka dapat dielusidasi dengan metode spektrofotometri.
6. Elusidasi Struktur
Senyawa hasil isolasi diidentifikasi strukturnya dengan menggunakan spektrofotometri massa dan spektrofotometri UV-VIS.
a. Spektrometri massa Senyawa hasil isolasi sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 10,0 mL
methanol. Larutan tersebut di milipore dan di degassing dengan ultrasonikator, lalu diinjeksikan pada kromatografi gas-spektrometri massa KG-SM. Sehingga
didapatkan peak hasil pemisahan campuran, serta spektra massanya. b. Spektrometri UV-VIS
Senyawa hasil isolasi sebanyak 1 mg dilarutkan dengan pelarut kloroform 10,0 mL, kemudian larutan dimilipore. Pada larutan tersebut dilakukan
scanning panjang gelombang dari 200 nm – 800 nm. Sehingga didapatkan spektra untuk mengetahui gugus-gugus yang mengandung kromofor.
F. Analisis Hasil
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini adalah analisis kualitatif dengan membaca spektra massa dan spektra UV-VIS. Analisis ini dilakukan
dengan membandingkan spektra yang didapat dengan pustaka yang diacu. Sehingga diketahui senyawa dengan berat molekulnya dengan spektra massa. Dari
spektra massa yang didapatkan dibandingkan dengan database yang ada. Kepastian senyawa dapat dilihat dari similarity index yang ditampilkan, serta
dibuktikan dengan reaksi fragmentasinya. Semakin mendekati 100, similarity index-nya, maka semakin besar kemungkinan kesamaan senyawanya. Sedangkan
