41
organik, semakin banyak gugus polar maka semakin larut dalam pelarut polar seperti air. Begitu pula sebaliknya, pelarut non-polar akan lebih sulit untuk melarutkan
senyawa-senyawa polar. Sehingga dapat dilihat bahwa senyawa fenolik flavonoid dan tanin dan alkaloid larut dalam pelarut polar, karena memiliki gugus hidroksil,
sehingga memiliki kemungkinan yang kecil untuk tersari dalam pelarut n-heksana non-polar yang digunakan dalam ekstraksi simplisia daun binahong. Sedangkan
terpenoid triterpenoid, steroid, saponin, dan karotenoid yang larut lipid dalam sel tumbuhan dapat larut dalam pelarut n-heksana.
J. Hipotesis
Oleh karena itu, dapat dibuat hipotesis bahwa struktur senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong
merupakan turunan golongan triterpenoid, steroid, saponin, dan karotenoid. Elusidasi struktur senyawa golongan tersebut akan dapat dilakukan dengan spektrometri massa,
spektrometri ultraviolet-sinar tampak UV-Vis, spektrometri inframerah IR, dan spektrometri resonansi magnetik inti hidrogen RMI-H.
42
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian non-eksperimental dengan rancangan penelitian bersifat deskriptif analitik.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Klasifikasi Variabel
a. Variabel bebas: ekstrak n-heksana daun binahong. b. Variabel tergantung: senyawa metabolit sekunder yang terkandung
dalam ekstrak n-heksana daun binahong.
2. Definisi Operasional
a. Ekstrak yang dianalisis dalam penelitian ini adalah ekstrak n-heksana daun binahong dibuat dengan proses maserasi serbuk daun binahong dengan n-
heksana sebanyak tiga kali. b. Fraksi merupakan gabungan eluat hasil pemisahan ekstrak n-heksana
daun binahong dengan kromatografi kolom yang memiliki profil KLT yang sama, dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform. Masing-masing fraksi diberi
nomor, dan fraksi IV merupakan fraksi dengan nomor empat. c. Senyawa yang dielusidasi struktur adalah senyawa metabolit sekunder
yang terkandung dalam isolat yang didapatkan dari isolasi fraksi IV ekstrak n- heksana daun binahong dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
C. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman binahong, air mengalir, akuades, n-heksana, Wagner LP, Mayer LP, Dagendorff
LP, HCL 2N, amonia pekat P, eter P, kloroform, natrium sulfat anhidrat P, asam asetat anhidrat P, Molish LP, asam sulfat P, metanol P, Baljet LP, Kadde LP,
kalium hidroksida 1N, asam klorida pekat P, xantidrol P 0,01 bv dalam asam asetat P, asam asetat P, besi III klorida 0,3 M, asam sulfat 2 N, benzena P,
natrium, hidroksida 2 N, serbuk seng P, asam klorida 2 N, asam klorida pekat P, etanol 95 P, serbuk magnesium P, FeCl
3
1 , gelatin, asam klorida 2 N, pereaksi Liebermann-Burchard, silika gel for column chromatography, silika gel
GF 254, kloroform p.a., dan metanol p.a.
D. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, oven, blender, pengayak nomor 40, shaker, erlenmeyer, kertas saring, pompa
vakum, labu hisap, sendok plastik, vakum rotary evaporator, labu alas bulat, batang pengaduk, tabung reaksi, cawan arloji, cawan porselin, pipet ukur, pipet
tetes, penangas air, bunsen, kolom kromatografi 1,8 x 30 cm, flakon, stopwatch, corong pisah, pipa kapiler, plat kaca 5 x 15 cm, plat kaca 20 x 20 cm, chamber
KLT, TLC Plate Coater, spatula, penyemprot KLT, spatula, UV cabinet, desikator, millipore ukuran pori 0,45 µm, ultrasonikator, seperangkat alat
spektrometer UV-Vis, dan seperangkat alat kromatografi gas-spektrometer massa,.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman Binahong
Determinasi tanaman binahong dilakukan dengan membandingkan tanaman binahong yang akan digunakan dalam penelitian dengan keterangan pada
Flora of Java Backer dan Van den Brink, 1965. Kemudian tanaman binahong dibuat herbariumnya dalam bentuk kering meliputi akar, batang, daun, bunga, dan
rimpang.
2. Preparasi Sampel
a. Pemilihan sampel. Sampel yang dipilih adalah daun tanaman binahong yang segar dan tidak berpenyakit tidak dijangkiti oleh infeksi virus, bakteria atau
jamur. Pada saat mengumpulkan sampel, harus dipastikan bahwa daun tepisah dari pencemar lain seperti tangkai binahong, atau bahan lain selain daun binahong.
Daun binahong yang dikumpulkan berasal dari daerah Yogyakarta. Daun dikumpulkan pada pagi hari dan diambil dengan cara dipetik daun kelima dari
pucuk ke bawah. Daun yang diambil adalah daun dewasa yang berukuran panjang 5-10 cm, dengan warna daun hijau tua, serta daun yang utuh dan tidak berlekuk-
lekuk. b. Pengeringan sampel. Daun segar tanaman binahong dibersihkan
sampai bersih dengan air mengalir dan dipisahkan dari pengotor lain debu, tanah, tangkai daun, batang, dan rimpang. Daun yang telah dicuci ditiriskan dan
dikeringanginkan untuk menghilangkan air sisa pencucian. Daun segar dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 40-60
⁰C. Simplisia dalam
bentuk daun kering kemudian diserbuk dengan blender dan diayak dengan pengayak nomor 40.
c. Ekstraksi sampel. Serbuk daun binahong, dibagi dalam beberapa Erlenmeyer bertutup dimana masing-masingnya berisi 25,0 gram serbuk daun
binahong, dimaserasi dengan 250 mL n-heksana selama 3 jam. Ekstrak hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan pompa
vakum. Terhadap bagian residu diekstraksi kembali dengan n-heksana dan dilakukan sebanyak dua kali. Filtrat yang didapatkan dari tiap ekstraksi dicampur
dan dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 40 ⁰C sampai terbentuk
ekstrak kental.
3. Uji Pendahuluan Ekstrak
a. Identifikasi flavonoid. Terdapat tiga cara dalam mengidentifikasi flavonoid dalam ekstrak yaitu:
i. 1 mL ekstrak diuapkan hingga kering, kemudian dilarutkan dalam 1 mL sampai 2 mL etanol 95 P; tambahkan 0,5 mg serbuk seng P dan 2 mL
asam klorida 2 N, diamkan selama 1 menit. tambahkan 10 tetes asam klorida pekat P; jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif,
menunjukan adanya flavonoid glikosida 3-flavonol. ii. 1 mL ekstrak diuapkan hingga kering, kemudian dilarutkan dalam 1
mL etanol 95 P, tambahkan 0,1 g serbuk magnesium P, jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu, menunjukan adanya flavonoid. jika terjadi
warna kuning jingga, menunjukan adanya flavon, kalkon, dan auron.
