Alkaloid Metabolit Sekunder pada Tanaman 1. Senyawa fenolik

19 Gambar 4. Proses kromatografi kolom Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991 Menurut Székely cit., Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995 kombinasi proses isolasi untuk senyawa lipofil dapat dilakukan dengan; partisi cair- cair dan kromatografi cair, kromatografi cair dan kromatografi padat misalnya kombinasi kolom terbuka dengan KLT preparatif menggunakan silika gel, ataupun kombinasi kromatografi cair. Kromatografi kolom terbuka biasa dipakai secara luas karena sederhana. Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar lebih dari 1 g. Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Fase gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa akan bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. 20 Ukuran partikel fase diam untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Untuk kolom yang dijalankan dengan gaya tarik bumi biasanya 63-250 µm. sedangkan kolom yang dijalankan dengan tekanan mengandung partikel fase diam dengan ukuran 40-63 µm. Silika gel SiO 2 atau asam silikat merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena dapat dipakai dengan semua pelarut Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991. Fase diam dapat dikemas ke dalam tabung dengan cara basah maupun kering. Umumnya cara basah lebih mudah dan lebih sering dipakai untuk silika gel. Sedangkan cara kering lebih baik untuk alumina. Pada cara basah, fase diam dimasukkan ke dalam kolom, dan tabung diisi sepertiganya dengan pelarut. Pelarut yang dipakai pada proses pengemasan ini mungkin sama dengan fase gerak atau pelarut lain yang kepolarannya lebih rendah. Fase diam dibuat suspensi dengan pelarut, dan suspensi ini dituangkan ke dalam pelarut yang ada di tabung. Selama proses pengendapan, tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahan agar dapat diperoleh lapisan yang seragam Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991 Pendekatan untuk memilih fase gerak ada tiga. Pertama dengan penelusuran pustaka, karena sebagian besar senyawa pada kimia analitik, biokimia, dan kimia obat diketahui dan pernah dikromatografi. Ketika senyawa belum diketahui atau senyawa yang tidak biasa, maka dapat dicari informasi mengenai senyawa yang ukuran serupa dan memiliki gugus fungsi yang sama. Kedua adalah hubungan dengan KLT. Karena KLT membutuhkan waktu yang singkat dengan menggunakan pelarut fase gerak yang sesedikit mungkin, maka agak mudah untuk dapat menentukan kondisi untuk