Fraksi IV yang telah dikumpulkan, dipekatkan dengan diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 40°C, agar didapatkan
fraksi kental yang senyawanya tidak terdegradasi.
Gambar 26. Hasil uji identifikasi fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong, a dengan eluen kloroform, b eluen kloroform setelah disemprot
reagen Liebermann-Burchard, c eluen kloroform:metanol 1:1, d eluen kloroform:metanol 1:1 setelah disemprot reagen Liebermann Burchard, e
eluen metanol, dan f eluen metanol setelah disemprot reagen Liebermann- Burchard
Tabel X. Hasil identifikasi fraksi IV dengan KLT
Gambar No. bercak
Nilai Rf Warna Sebelum
Disemprot LB Warna Setelah
Disemprot LB 26 a, b
1 0,02
Hijau kecoklatan Hijau kecoklatan
2 0,17
Kuning Hijau
26 c, d 1
0,54 Kuning
Hijau 26 e, f
1 0,59
Kuning Hijau
F. Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis preparatif KLTP
Oleh karena, pemilihan kromatografi kolom dalam awal proses isolasi merujuk pada Székely cit., Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995,
dimana krombinasi yang dapat dilakukan adalah dengan menggunakan kombinasi kolom terbuka yang dilanjutkan dengan KLT preparatif KLTP.
Pada KLTP, plat yang digunakan berbeda dengan yang digunakan pada KLT pada umumnya. Plat yang digunakan berukuran lebih besar yaitu 20 x 20
cm, serta fase diam yang digunakan lebih tebal dari plat KLT biasa. Pada penelitian ini digunakan fase diam silika gel GF
254
dengan ketebalan 0,5 mm, selain itu, jarak pengembangan diperpanjang menjadi 15 cm. pemanjangan jarak
pengembangan dilakukan untuk memaksimalkan pemisahan yang terjadi. Pada penelitian ini tidak dilakukan optimasi fase gerak terlebih dahulu.
Fase gerak yang digunakan berdasarkan hasil uji fraksi IV yang telah dilakukan. Dari ketiga fase gerak, kromatogram dengan fase gerak kloroform menghasilkan 2
bercak yang memisah dengan baik. Oleh karena itu, kloroform kembali digunakan untuk mengisolasi senyawa dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong.
Dalam mengisolasi, plat yang telah dibuat terlebih dahulu diaktifkan dalam oven selama 1 jam dengan suhu 110°C. Setelah plat dingin, plat ditotolkan
dengan fraksi IV. Penotolan dilakukan membentuk pita, dengan menotolkan fraksi IV berjejer dan rapat. Setelah pelarutnya menguap, plat dimasukan kedalam
chamber yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan kloroform sebagai fase gerak, dan dikembangkan dengan jarak pengembangan 15 cm. Setelah mencapai
pengembangan yang diinginkan, plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan.
Gambar 27. Hasil KLTP Tabel XI. Hasil KLTP
Gambar No. bercak
Jarak Bercak Nilai Rf
Warna 27
1 Hijau muda
2 3,5
0,23 Kuning
3 5,8
0,38 Kuning
Dari gambar hasil KLTP dapat dilihat adanya tiga pita yang menunjukan adanya tiga senyawa. Yang diisolasi adalah senyawa pada pita pertama karena
pita ini menunjukkan pemisahan yang baik dan pita tidak mengekor. Pita pertama kemudian dikerok dan diekstraksi dengan menggunakan kloroform. Isolat encer
ini kemudian dikentalkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator.
Gambar 28. Isolat pekat dari proses isolasi
Isolat yang didapatkan dianalisis kemurniannya menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Plat KLT aktif dengan fase diam silika ditotolkan dengan
isolat kental. Kemudian plat KLT tadi dikembangkan dengan 3 fase gerak yang berbeda kepolarannya, yaitu dengan fase gerak kloroform, kloroform:metanol
1:1, dan metanol.
Gambar 29. Uji kemurnian isolat: a dengan eluen kloroform, b dengan eluen metanol-kloroform 1:1, dan c dengan eluen metanol
Tabel XII. Uji kemurnian isolat
Gambar No. bercak
Nilai Rf Warna
29. a 1
0,18 Kuning
29. b 1
0,55 Kuning
29. c 1
0,58 Kuning
Dari kromatogram didapatkan bahwa, dari ketiga fase gerak yang berbeda, dihasilkan hanya 1 bercak dan tidak mengekor. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa isolat yang dihasilkan telah murni secara kromatografi lapis tipis. Karena telah dapat dikatakan murni, isolat dapat dielusidasi strukturnya
dengan metode spektroskopi.
G. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa KG-SM
Dalam elusidasi struktur, salah satu metode yang digunakan adalah spektroskopi massa SM. Penggunaan spektrometri massa dilakukan untuk
mengetahui berat molekul senyawa yang dianalisis. Penggunaan kromatografi gas yang digabung dengan spektroskopi massa
lebih efektif, karena pada KG-SM, sampel yang menguap akan memisahkan senyawa-senyawa dari campuran maupun pengotornya, dimana masing-masing
akan senyawa yang telah terpisah dianalisis tersendiri dalam spektroskopi massa. Spektra yang didapatkan tidak hanya dapat memberikan informasi
mengenai berat molekulnya saja, tetapi juga dapat mengetahui informasi tentang struktur molekulnya dengan interpretasi fragmentasinya.
Selain itu, menurut Kosela 2010, mengidentifikasi struktur senyawa saat ini lebih mudah karena telah disusunnya database spektra berbagai senyawa
organik, sehingga spektra sampel yang dianalisis dibandingkan dengan spektra
dari database yang ada dengan derajat kemiripan tertentu. Semakin tinggi derajat kemiripannya, semakin besar kemungkinan kedua senyawa identik.
Dalam proses ini, pertama-tama isolat pekat yang didapatkan diinjekkan pada sistem KG-MS, dengan kolom Rastek RXi-5MS dengan fase diam
merupakan campuran 95 dimenthil 5 difenil polisiloksan, dengan panjang kolom 30 meter dan diameter 0,25 mm. Gas pembawa yang digunakan merupakan
gas inert yaitu gas helium. Dalam proses kromatografi, isolat teruapkan dan terbawa masuk ke
dalam kolom. Suhu awal kolom 80°C yang dinaikan secara kontinyu hingga 305°C dan tetap selama 20 menit. Pemrograman suhu dilakukan untuk
memperbesar kemungkinan isolat seluruhnya teruapkan dan stabil dalam kondisi uap selama di dalam kolom.
Gambar 30. Kromatogram KG-SM isolat
