Pemisahan terbaik didapatkan pada kromatogram dengan eluen kloroform yang menghasilkan bercak paling banyak dan terpisah dari bercak
lainnya, serta banyak bercak yang tidak mengekor. Sehingga dapat disimpulkan bahwa eluen terbaik untuk proses kromatografi kolom adalah kloroform.
2. Proses kromatografi kolom
Karena eluen yang digunakan adalah kloroform, maka silika gel yang akan dimasukkan ke dalam kolom, terlebih dahulu disuspensikan ke dalam
kloroform. Penuangan suspensi kloroform ke dalam kolom harus dilakukan secara hati-hati dengan meminimalkan timbulkan gelembung udara maupun aliran
turbulen. Gelembung udara ini dapat menyebabkan ketidakkompakan silika, sehingga akan mengganggu proses pemisahan. Selain itu, kolom dijaga dari
keringnya silika dengan menjaga aliran eluen yang kontinyu 4 tetes tiap 3 detik. Sehingga pada bagian atas kolom dihubungkan dengan corong pisah yang berisi
eluen kloroform. Fase diam yang digunakan adalah silika gel untuk column
chromatography yang dimasukkan ke dalam kolom kaca yang dilengkapi dengan pengatur aliran semacam keran serta suatu saringan yang berfungsi untuk
menyangga fase diam. Suspensi silika gel dimasukkan ke dalam kolom hingga padatan silika memiliki tinggi 20 cm.
Sebanyak 0,5 mL ekstrak n-heksana daun binahong dipipet ke bagian atas silika gel di dalam kolom kaca, kemudian eluen kloroform dialirkan
kedalam kolom sesuai dengan kecepatan aliran eluen keluar dari kolom. Eluat yang keluar ditampung setiap 3 menit.
Gambar 24. Kromatografi Kolom Ekstrak n-Heksana Daun Binahong 3. Uji kemurnian eluat kromatografi kolom dengan metode KLT
Untuk menganalisis kemurnian eluat yang didapatkan, dilakukan proses kromatografi lapis tipis, dimana masing-masing eluat ditotolkan pada plat silika
gel GF
254
dan kemudian dielusi dengan kloroform. Setelah pengembangan dilakukan dengan jarak 10 cm, plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan,
serta dianalisis profil kromatogramnya.
Gambar 25. Hasil KLT masing-masing eluat dari kromatografi kolom Tabel IX. Hasil KLT eluat dari kromatografi kolom
Gambar No. bercak
Nilai Rf Warna
25 a 1
0,88 Kuning
25 b 1
0,89 Kuning
2 0,81
Hijau 25 c
1 0,70
Hijau 2
0,82 Hijau kekuningan
3 0,89
Kuning 25 d
1 0,66
Hijau 25 e
1 0,65
Hijau 25 f
1 0,65
Hijau 25 g
1 0,35
Hijau 25 h
1 0,36
Hijau 25 i
1 Hijau tua
2 0,33
Kuning 25 j
1 Hijau tua
2 0,32
Kuning 25 k
1 Hijau tua
2 0,32
Kuning
Eluat dengan profil kromatogram yang sama digabung. Maksudnya adalah eluat yang menghasilkan bercak dengan Rf dan warna yang sama. Eluat-
eluat yang didapatkan dibagi menjadi 4 fraksi yang merupakan gabungan dari eluat dengan profil yang sama.
Fraksi pertama I merupakan gabungan eluat dengan bercak yang dihasilkan pada kromatogram dengan fase gerak kloroform dengan Rf 0,86-0,92
dan berwarna kuning. Fraksi kedua II merupakan gabungan eluat dengan Rf 0,70-0,85 dengan warna hijau tua. Fraksi ketiga III merupakan gabungan eluat
dengan Rf 0,4-0,68 dengan warna hijau tua. Serta, fraksi keempat IV memiliki Rf 0,20-0,40. Serta fraksi kelima V yang memiliki Rf 0-0,05 tidak terelusi
dengan warna hijau tua. Fraksi I telah dianalisis oleh Du’a 2012 dengan menggunakan KG-SM,
spektroskopi UV-Vis, serta dengan menggunakan Spektroskopi inframerah. Dalam penelitiannya, didapatkan bahwa fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong
mengandung steroid serta beberapa asam lemak dan turunannya. Fraksi II, III, dan V tidak dianalisis karena adanya dugaan kuat
merupakan klorofil dengan jenis yang berbeda karena berwarna hijau. Fraksi IV sangat berpotensial untuk dianalisis karena kecil kemungkinan
mengandung klorofil karena berwarna kuning, serta menghasilkan reaksi positif untuk Liebermann-Burchard menjadi warna hijau, yang menunjukkan adanya
steroid. Analisis ini juga dilakukan untuk memastikan struktur steroid apa yang terkandung dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong.
Fraksi IV yang telah dikumpulkan, dipekatkan dengan diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 40°C, agar didapatkan
fraksi kental yang senyawanya tidak terdegradasi.
Gambar 26. Hasil uji identifikasi fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong, a dengan eluen kloroform, b eluen kloroform setelah disemprot
reagen Liebermann-Burchard, c eluen kloroform:metanol 1:1, d eluen kloroform:metanol 1:1 setelah disemprot reagen Liebermann Burchard, e
eluen metanol, dan f eluen metanol setelah disemprot reagen Liebermann- Burchard
Tabel X. Hasil identifikasi fraksi IV dengan KLT
Gambar No. bercak
Nilai Rf Warna Sebelum
Disemprot LB Warna Setelah
Disemprot LB 26 a, b
1 0,02
Hijau kecoklatan Hijau kecoklatan
2 0,17
Kuning Hijau
26 c, d 1
0,54 Kuning
Hijau 26 e, f
1 0,59
Kuning Hijau
