disentrifus. Filtrat dievaporasi untuk menghilangkan etanol. Sebelum ke HPLC, terlebih dahulu filtrat disaring dengan millipore 0.45 um.
Konsentrasi masing-masing komponen oligosakarida ditentukan dengan menggunakan HPLC dengan menggunakan kolom aminex Ion Exclusion HPX-
87H 300 mm x 7.8 mm, BioRAD dan detektor RI Model 1755. Fase gerak adalah asam sulfat 0.005M dengan laju alir 0.5 mlmenit. Menggunakan standar
Glukosa, fruktosa, sukrosa, rafinosa, stakhiosa.
15. Pemisahan fraksi karbohidrat Modifikasi Gulewicz et al. 2000
Ekstrak gula pada tahap 14 ditambahkan 100 etanol sambil distirer. Rasio ekstrak air dan 100 etanol adalah 1:10. Selanjutnya disentrifus pada 3000 rpm
selama 15 menit, dan endapannya dihilangkan residu etanolnya. Ekstrak kasar gula dilarutkan dalam air destilasi 25 ml dan ditempatkan
pada sintered glass funnel ukuran pori G4 yang berisi diatomaceous earth dan charcoal 1:1, ww dan dihubungkan dengan vacum. Funnel selanjutnya dielusi
dengan air dan oligosakarida dielusi dengan 70 etanol. Setelah itu dievaporasi dengan rotavapor vacum suhu 50
o
C. Ekstrak oligosakarida sekitar 3 g dilarutkan dalam 10 ml air destilasi kemudian dielusi pada kolom yang berisi Dowex
50WX8 dan dicuci dengan air destilasi hingga oligosakarida tidak terdeteksi dalam eluat. Larutan selanjutnya diliofilisasi. Fraksi oligosakarida yang murni
selanjutnya digunakan untuk analisis in vitro sebagai pengganti glukosa pada media pertumbuhan bakteri asam laktat dan bifidobakterium.
Konsentrasi masing-masing komponen oligosakarida ditentukan dengan menggunakan HPLC dengan menggunakan kolom aminex Ion Exclusion HPX-
87H 300 mm x 7.8 mm, BioRAD dan detektor RI Model 1755. Fase gerak adalah asam sulfat 0.005M dengan laju alir 0.5 mlmenit. Menggunakan standar
Glukosa, fruktosa, sukrosa, raffinosa, stakhiosa.
16. Pengujian fraksi karbohidrat secara In Vitro Kaplan Hutkins 2000
Pengamatan pertumbuhan bakteri asam laktat pada media agar dilakukan dengan membuat media pertumbuhan dasar MRS tanpa karbohidrat yang terdiri
dari 0.05 L-sistein, 1.5 agar dan 30 mg bromcresol purple per liter. Media dasar tersebut selanjutnya diautoklaf sedangkan fraksi karbohidrat yang diuji
difilter steril kemudian ditambahkan ke media agar. Masing-masing strain
bakteri uji yang sebelumnya ditumbuhkan pada MRSB selanjutnya ditumbuhkan pada media agar yang mengandung fraksi karbohidrat dengan jumlah koloni
berkisar antara 25-50 koloni. Cawan agar kemudian diinkubasi pada kondisi anaerob selama 24 jam. Strain bakteri yang dapat memfermentasi fraksi
karbohidrat yang diuji dan memproduksi asam sebagai produk akhirnya tumbuh sebagai koloni yang dikelilingi oleh zona berwarna kuning 3 mm dengan latar
belakang berwarna abu-abu. Sementara koloni yang tidak dapat memfermentasi fraksi karbohidrat uji menghasilkan koloni berwarna putih kecil tanpa zona
berwarna kuning.
17. Pengambilan contoh pada metode in vivo
Pengambilan contoh untuk analisis mikroba isi sekum dan mukosa sekum dilakukan secara bertahap, yaitu awal sebelum perlakuan, 2 minggu setelah
perlakuan, 3 minggu setelah perlakuan dan 4 minggu setelah perlakuan. Pada saat pengambilan contoh tikus dibius dengan menggunakan dietil eter dan dibedah
untuk diambil bagian usus. Untuk pengamatan mikroba usus, pengambilan contoh dilakukan dengan mengeluarkan lumen dari sekum dengan menggunting
dinding usus. Selanjutnya sesegera mungkin dilakukan pengujian mikroba utama usus. Untuk mengambil contoh mikroba mukosa, terlebih dahulu sekum dicuci
dengan larutan garam fisiologis steril hingga isi sekum sudah tidak ada yang menempel, dinding mukosa dikerik secara aseptis pada luasan 1 cm
2
dengan spatula steril dan contoh dimasukkan dalam larutan garam fisiologis steril.
Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat seperti Lactobacillus spp. adalah MRS agar yang ditambahkan CaCO
3
dengan waktu inkubasi 3 hari. Setelah memadat, inkubasi anaerob dilakukan menggunakan
anaerobic jar dengan gas generating kit pada temperatur 37°C Fardiaz 1989. Media pertumbuhan E. coli adalah Eosin Methylen Blue Agar waktu inkubasi 3
hari, inkubasi secara aerob. Setelah inkubasi, mikroba diidentifikasi morfologi koloni, morfologi sel,
pewarnaan gram serta uji katalase dan jumlah koloni spesifik dihitung dengan metode hitungan cawan. Hasil kuantifikasi dinyatakan dalam log CFU per gram
isi sekumlumen.
