120
kering dapat dilakukan secara cepat untuk mendapatkan informasi awal
tentang penampakan atau status kesehatan benih. Tetapi metode ini
hanya mendeteksi cendawan yang ada di permukaan benih atau
tercampur bersama benih serta kondisi fisik benih saja. Metode ini
dapat digunakan untuk mendeteksi patogen yang menyebabkan gejala
khas pada benih misalnya disklorisasi atau perubahan warna pada kulit
benih, perubahan ukuran, dan bentuk benih. Metode ini juga dapat
digunakan untuk mendeteksi patogen yang menghasilkan struktur tubuh
buah yang dapat dilihat secara visual pada benih atau tercampur pada
benih.
Sebagai tambahan metode ini berguna untuk mengetahui adanya
seranganinfestasi serangga benih atau kerusakan benih atau melihat
adanya perlakuan benih dengan pestisida. Metode ini berkaitan
langsung dengan kegiatan analisis kemurnian benih purity, yaitu apakah
benih tercampur dengan benda-benda dan benih lainnya dalam proses
pemberian sertifikasi benih.
Berdasarkan peraturan Internasional Seed Testing
Association ISTA benda-benda tercampur benih antara lain butiran
tanah, pasir, batu, sisa tanaman, puru nematoda, maupun tubuh buah
cendawan seperti sklerotia, smut bunt yaitu butiran benih yang telah terisi
struktur cendawan. Unsur-unsur yang tercampur dengan benih tersebut
sangat potensial dalam perkembangan dan penyebaran suatu
patogen, karena berbagai cendawan mampu bertahan pada sisa-sisa
tanaman atau butiran-butiran tanah. Benih yang mengalami diskolorasi
maupun yang mengandung patogen infeksi tidak dicantumkan dalam
analisis kemurnian benih, oleh karena itu perlu ada kerjasama dari petugas
yang menangani kemurnian benih dengan petugas yang menangani
kesehatan benih sebelum menerbitkan sertifikat benih.
Prosedur : Metode ini bersifat kualitatif, sehingga
tidak ada standar dalam jumlah contoh benih tertentu yang digunakan
dalam pengujian.
c. Metode Pencucian Benih
Metode pencucian benih terutama dilakukan untuk mendeteksi
cendawan yang membentuk struktur di permukaan benih. Pengujian dapat
dilakukan secara cepat dan mudah, namun pengujian dengan cara ini
memiliki keterbatasan karena cendawan yang berada di dalam
jaringan benih tidak dapat diketahui atau terdeteksi. Hasil pengujian
tersebut tidak dapat menggambarkan tingkat infeksi dan infestasi patogen
pada benih.
Sebagaimana pengamatan secara visual terhadap benih kering,
dalam metode pencucian benih tidak ada standar dalam jumlah benih yang
diuji. Prosedur yang biasa digunakan di berbagai laboratorium adalah
sebagai berikut : Prosedur pencucian benih adalah
sebagai berikut: Sebanyak 50 gr benih dari 1 kg benih contoh
dimasukan ke dalam gelas Erlenmeyer kemudian ditambahkan
Di unduh dari : Bukupaket.com
121
100 ml air steril. Untuk memudahkan peluruhan struktur cendawan dari
permukaan benih sering ditambahkan 1 tetes Twin 20. Benih tersebut
dikocok selama 5 menit dengan shaker selanjutnya disaring dengan
kain kasa. Air hasil pencucian dimasukan dalam tabung sentri-fugasi
dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1500–2000 rpm selama 3
menit. Sedimen yang terbentuk dipisahkan dengan air dengan cara
membuang air tersebut menggunakan pipet.
Selajutnya dilakukan pengamatan mikroskopis; sebanyak 1 ml lactofenol
ditambahkan pada sedimen dalam tabung dan dicampur hingga merata.
Dengan menggunakan pipet, campuran sedimen diteteskan pada
gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup dan selanjutnya dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100–400 kali
untuk melihat struktur cendawan. Bila pendekatan kuantitatif diperlukan,
maka pengamatan dapat menggunakan haemacytometer untuk
mengetahui kepadatan inokulum cendawan per satuan berat benih.
d. Metode Inkubasi
Prinsip pengujian benih dengan metode inkubasi adalah memberikan
kondisi tumbuh yang optimal bagi mikroorganisme terbawa benih, baik
yang ada di permukaan ataupun yang ada di dalam jarungan benih. Dengan
cara tersebut maka mikro-organisme patogen terbawa benih, terutama
cendawan dan bakteri dapat terdeteksi dengan mengamati
karakteristik pertumbuhan dan struktur cendawan. Pengujian kesehatan
benih dengan metode inkubasi yang sering dilakukan adalah pengujian
dengan media kertas Blotter-test, dan pengujian pada media agar.
Metode Inkubasi dengan Media Kertas Blotter-Test Metode Blotter
adalah salah satu dari metode inkubasi, yaitu benih ditumbuhkan
pada kertas saring basah, diinkubasikan selama 7 hari dengan
penyinaran lampu ultra violet selama 12 jam terang dan selama 12 jam
kondisi gelap secara bergantian. Benih yang diinkubasi tersebut diamati
di bawah mikroskop dengan pembesaran 50–60 kali untuk melihat
pertumbuhan cendawan.
Cendawan yang tumbuh diamati dan didekteksi berdasarkan
karakteristik keberadaan tumbuhnya seperti tubuh buah, konidia yang
muncul dari konidiofor tangkai konidia, spora dengan massa
sporanya, sporodokium dan aservulus, piknidiospora da-lam
piknidia, dan askospora dalam peritesia.
1 Metode inkubasi dengan media kertas saring
Sebanyak 400 benih diletakkan dalam cawan petri berdiameter 9 cm.
Jumlah benih per cawan petri 10 atau 25 tergantung dari ukuran benih. Tiap
cawan petri diberi label nomor benih dan tanggal pengujian. Sebelum benih
diletakkan, cawan dialasi dengan 2 lapis kertas saring yang telah
dicelupkan ke dalam air bersih. Usahakan jangan terlalu banyak air
tidak tergenang. Letakan benih satu
Di unduh dari : Bukupaket.com
122
per satu dengan menggunakan pinset seperti Gambar 2.
Selanjutnya benih diinkubasi pada suhu kamar dengan penyinaran lampu
ultra violet 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian selama 7
hari. Pada hari ke-8 dilakukan pengamatan dengan menggunakan
mikroskop stereo. Pada tiap benih diamati karakteristik pertumbuhan
berbagai cendawan yang tumbuh. Kadang-kadang sangat sulit
mengidentifikasi cendawan melalui pengamatan karakteristik
pertumbuhan cendawan, oleh karena itu dibuat preparat dari cendawan
tersebut dan diamati dengan bantuan mikroskop compoun dan kunci
identifikasi. Jika suatu cendawan telah teridentifikasi, dituliskan kode
cendawan pada kertas blotter didekat cendawan yang bersangkutan.
Jumlah benih yang terinfeksi suatu cendawan dihitung sebagai tingkat
infeksi cendawan pada contoh benih yang diuji.
2 Metode inkubasi dengan media kertas dengan pendinginan
Sebanyak 400 benih diletakkan dalam cawan petri yang telah dialasi
kertas saring seperti pada metode inkubasi dengan kertas standar.
Benih diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang dengan penyinaran lampu
ultra violet 12 jam terang dan 12 jam gelap. Pada hari ke-2 benih disimpan
pada suhu –20
o
C selama 24 jam. Tujuan perlakuan pendinginan
tersebut adalah untuk menghambat atau menekan perkecambahan benih.
Hal ini disebabkan sering perkecambahan benih menyulitkan
secara teknis dalam pengamatan sehingga informasi menjadi bias.
Setelah diberi perlakuan dingin kemudian benih diinkubasi selama 5
hari pada suhu ruang dengan penyinaran lampu ultra violet 12 jam
terang dan 12 jam gelap secara bergantian.
Pada hari ke-8 benih diamati seperti prosedur pengamatan metode
inkubasi dengan media kertas standar.
3 Metode inkubasi pada media agar Dalam metode media agar
inokulum terbawa benih, dideteksi berdasarkan karakteristik koloni pada
media agar yang berkembang dari benih. Secara umum prinsipnya sama
dengan prinsip dari pengujian dengan media kertas. Dalam beberapa hal
metode ini memiliki kelebihan, yaitu memberikan informasi relatif lebih
cepat dan cukup menggambarkan status kesehatan benih dibandingkan
dengan metode media kertas, karena ketersediaan nutrisi pada media agar
memungkinkan cendawan atau bakteri tumbuh dan berkembang secara lebih
baik dan lebih cepat sehingga memudahkan dalam pengamatan.
Biasanya cendawan atau bakteri akan membentuk koloni yang khas pada
media agar.
Dalam pelaksanaan pengujian dengan media agar memerlukan
persiapan yang lebih lama, relatif rumit dan mahal, terutama bila
menggunakan media spesifik. Sering terjadi kesulitan dalam pengamatan
karena pertumbuhan koloni cendawan atau bakteri men-jadi berbeda atau
berubah bila menggunakan media
Di unduh dari : Bukupaket.com
123
tumbuh yang berbeda dengan waktu yang berbeda pula. Kesulitan lain
pada waktu pengamatan adalah pertumbuhan cendawan bukan
sasaran cendawan saprofit tumbuh lebih ekstensif sehingga menekan
pertumbuhan cendawan patogen yang menjadi sasaran pengamat-an. Untuk
keperluan pengujian dengan media agar digunakan berbagai jenis media
tumbuh seperti PDA dan media semi selektif atau selektif seperti Czapek,
Media BSC, Media Komada, dan lain- lain.
Prosedur metode inkubasi pada media agar adalah sebagai berikut:
Media agar steril disiapkan dalam cawan petri steril. Sebanyak 400
benih dari satu contoh benih diberi perlakuan sterilisasi permukaan
dengan NaOCL 1 selama 3 menit. Kemudian benih ditiriskan pada kertas
saring steril. Dalam banyak kasus, perlakuan sterilisasi pada permukaan
benih tidak dilakukan.
Benih diletakkan pada media agar dalam cawan petri. Tiap cawan
ditanami 10 butir benih. Pekerjaan penanaman benih tersebut dilakukan
secara aseptik, yaitu membersihkan tempat dan alat kerja dengan bahan
aseptik seperti alkohol 70 . Benih diinkubasi pada suhu kamar selama 7
hari dengan penyinaran lampu ultra violet 12 jam terang dan 12 jam gelap
secara bergantian.
Pengamatan dilakukan pada hari ke-8 tetapi sering pula dilakukan mulai
hari ke-4, karena koloni cendawan sudah mulai tampak. Hal yang diamati
adalah karak-teristik koloni dan struktur cendawan. Untuk bakteri
bahkan peng-amatan sudah dapat dilakukan pada hari ke-2 atau ke-3.
e. Uji Gejala pada BibitKecambah
