124
tanaman. Beberapa patogen tidak mudah dideteksi dengan metode lain
karena serangan patogen tersebut yang bersifat laten. Sehingga
diperlukan fase tertentu pertumbuhan tanaman agar gejala dan
perkembangan patogen dapat dideteksi. Metode ini sangat
bermanfaat untuk pengujian contoh benih yang jumlahnya terbatas seperti
benih hasil pemuliaan pada tahap tertentu dan juga bermanfaat untuk
tujuan karantina. Pengujian gejala bibitkecambah dapat digunakan untuk
evaluasi efektivitas perlakuan benih, baik dengan kimia maupun secara
fisik.
Prosedur pengujian dengan metode media agar cair adalah
sebagai berkiut: Dengan media agar air water agar dilakukan dengan cara
sebagai berikut. Tuangkan 10 ml agar air ke dalam tabung reaksi ukuran
160x16 mm kemudia tutup dengan kapas dan selanjutnya disterilisasi
pada temperatur 121o C selama 15 menit. Sebutir benih ditanam pada
media agar air steril. Sebelum dan sesudah penanaman, tabung tetap
tertutup dengan kapas. Penanaman dikerjakan secara aseptik. Tabung
reaksi yang berisi media agar air dan benih kemudian diletakkan pada rak
tabung reaksi dan diinkubasikan sampai 14 hari pada temperatur ruang
dengan penyinaran lampu ultra violet. Setelah masa inkubasi diamati gejala
yang timbul, koloni cendawan dan struktur cendawan. Pengamatan
sebenarnya bisa dilakukan selama masa inkubasi.
f. Uji Serologi
Uji ELISA Enzyme-Linked Immuno-sorbent Assays adalah
pengujian serologi terutama digunakan untuk mendeteksi bakteri
dan virus terbawa benih. Prinsip pengujian tersebut adalah reaksi in
vitro antara antigen dan antibodi. Dalam pengujian cara ini sangat
tergantung kepada ketersediaan sejumlah antibodi yang spesifik untuk
patogen sasaran. Uji ELISA sebagai salah satu metode serologi untuk
mendeteksi virus sering digunakan karena metode tersebut sederhana,
mudah dilakukan, cepat, sensitif, akurat, dan dapat digunakan untuk
menguji sampel dalam jumlah besar. Metode tersebut berdasarkan pada
konjugasi antara virus– antibodi dan enzim, dengan menambahkan
substrat pewarna maka adanya konjugasi tersebut dapat diperlihatkan.
Dalam uji ELISA ada beberapa cara yang digunakan yaitu indirect
ELISA, double antibody sandwich ELISA DAS ELISA, DAS ELISA
protocol, F ab’ 2 indirect ELISA dan F ab’2 ELISA protocol, tetapi yang
banyak digunakan adalah metode indirect ELISA dan double antibody
sandwich ELISA DAS ELISA. Dalam indirect ELISA uji didasarkan pada
adanya ikatan enzim dengan molekul antibody yang dapat dideteksi oleh
antiviral immunoglobulin. Sedangkan pada DAS ELISA, virus diikat oleh
antibody spesifik yang kemudian bereaksi lagi dengan antibody spesifik
yang telah diikat oleh enzim.
Dari segi praktikal indirect ELISA lebih sederhana dan lebih cepat
karena dalam indirect ELISA tidak
Di unduh dari : Bukupaket.com
125
melalui prosedur pemurnian virus, mempersiapkan stock gamma–
globulin lgG, dan mela-kukan konjugasi enzim–immuno-globulin.
Prosedur uji serologi adalah sebagai berikut: Antigen ekstrak
tanaman yang diuji harus dipersiapkan terlebih dahulu
Persiapan kontrol yaitu ekstrak tanaman sehat dan suspensi tanaman
yang positif terinfeksi virus dalam antigen buffer dengan pengenceran
150. Buat ekstrak antigen dengan cara menggerus jaringan tanaman
yang akan diuji kemudian diencerkan dengan antigen buffer dengan
pengenceran 19. Masukan antigen tersebu sebanyak 100
l pada setiap lubang plate ELISA.
Tutup plate ELISA dengan plastik tipis dan diinkubasikan selama 1 jam
pada suhu tumbuh 37o C atau semalaman pada suhu kamar.
Primary specific antiserum harus disiapkan terlebih dahulu. Selama
inkubasi atau sebelum uji dimulai dapat dilakukan cross–adsorbtion
antiserum dengan jaringan sehat dengan cara sebagai berikut.
Jaringan sehat dihancurkan dalam serum buffer dengan pengeceran
120. Suspensi disaring dengan menggunakan kain kasa. Encerkan
anti-serum sesuai anjuran dalam suspensi tersebut. Aduk sampai rata
dan inkubasi selama 45 menit pada suhu 37
o
C. Pencucian dilakukan dengan
langkah-langkah sebagai berikut. Kosongkan plate ELISA. Cuci plate
ELISA dengan PBS Tween, rendam selama 3 menit dengan PBS Tween,
ulangi sampai 4 kali cucian. Keringkan dengan kertas tissue. Masukan
primary antiserum 100 l setiap
lubang plate ELISA. Inkubasikan plate tersebut selama 1 jam pada suhu
37
o
C. Secondary antiserum conjugate
harus disiapkan setelah primery antiserum yaitu dengan cara:
Kosongkan plate ELISA dan cuci dengan cara seperti di atas. Masukan
konjugasi antibody– Alkaline phosphatase tersedia secara
komersial sebagai SWAREC = Swine antirabbit enzyme conju-gate pada
pengenceran 11000–12000 dalam serum buffer. Inkubasikan selama 1
jam pada suhu 37
o
C. Substrat dibuat setelah antiserum
siap untuk digunakan. Metoda pembuatan substrat adalah sebagai
berikut: Kosongkan plate ELISA dan cuci sebagaimana di atas. Buat
larutan substrat dari 1 tablet p– nitrophenyl PNPP, tersedia se-cara
komersial dalam 10–15 ml diethanolamine buffer DIEAB.
Masukan substrat tersebut 100
l per lubang. Inkubasikan selama 30 menit
pada suhu kamar. Reaksi positif yaitu apabila terjadi perubahan warna
menjadi kuning.
Baca nilai absorban ultra violet dengan menggunakan alat spektro-
fotometer. Untuk menghentikan reaksi dapat dilakukan dengan menambah
setetes 3 N NaOH pada tiap lubang.
Cara Pembuatan Buffer untuk Inderect ELISA :
PBS Phosphate Buffered Saline : a. 0,05 M KH2 PO4 Na2 HPO4 +
8,5 g Na Cl l b. pH 7,2
Di unduh dari : Bukupaket.com
126
Antigen buffer: i. PBS + 0,01 M NaDIECA.
PBS Tween untuk mencuci x 1 liter PBS Tween
x 0,2 g KCl. x 0,5 ml Tween 20
Serum buffer : x 1 liter PBS Tween
x 20 g Polyvinylpyrrolidone 2 MW = 25.000
x 2 g Ovalbumin 0,2 Substrate – Buffer : DIEAB :
Diethanolamine Buffer. x 100 ml diethanolamine
C4H11NO2. x 200 ml deinonized H2O
x 24 ml 5 N Hcl x buat suspensi dalam deionized
H2O sampai mencapai volume 1000 ml.
g. Uji Tanaman Indikator
