34
dilakukan terhadap responden yang sama yaitu yang telah diambil darahnya pada pengambilan darah sebelum intervensi. Darah tersebut juga mengalami perlakuan pendahuluan sebelum pada akhirnya
siap untuk dilakukan analisis.
6. Tahap Analisis Laboratorium Sampel Darah
a. Persiapan sampel serumplasma dan eritrosit
Untuk sampel plasma, darah diambil dengan menggunakan venojack bervolume 10 mL yang telah berisi antikoagulan EDTA. Sementara untuk sampel serum dengan menggunakan syringe
sebanyak 12 ml tanpa antikoagulan. Sampel darah yang telah didapat kemudian dimasukkan ke dalam falcon steril dan disentrifus 1500 rpm selama 10 menit untuk sampel plasma dan 4000 rpm 30 menit
untuk sampel serum. Maka untuk sampel plasma diperoleh tiga lapisan plasma, buffy coat,eritrosit, lapisan teratas kemudian dipisahkan sehingga diperoleh plasma. Untuk sampel serum akan diperoleh
dua lapisan. Bagian teratas kemudian dipisahkan sehinga diperoleh serum. Sampel serum dan plasma yang telah didapatkan dimasukkan ke dalam beberapa eppendorf dan disimpan pada suhu -25
o
C. Sampel eritrosit diperoleh dari persiapan sampel plasma dan serum, yaitu bagian dasar berwarna
merah pada falcon hasil sentrifus. Sampel tersebut juga disimpan pada suhu -25
o
C.
b. Analisis total antioksidan serumplasma
antioksidant assay kit Sigma Persiapan larutan 1x assay buffer
Larutan 1x Assay buffer di dapatkan dengan cara mengencerkan larutan assay buffer dengan aqua bidestilata dengan perbandingan assay buffer dan larutan adalah 1:10, kemudian di-
vortex hingga homogen.
Persiapan myoglobin solution
Myoglobin solution terdiri atas myoglobin stock dan myoglobin yang siap dipakai untuk analisis. Myoglobin stock diperoleh dengan cara menambah 285 µl aqua bidestilata ke dalam
vial yang berisi 1 mg myoglobin dari hati kuda dan di-vortex hingga rata. Myoglobin yang siap pakai myoglobin working solution untuk analisis diperoleh dari pengenceran myoglobin stock
dengan 1x assay buffer dengan pengenceran 100 kali.
Persiapan trolox working solution
Trolox working solution dibuat dengan menambahkan 2,67 ml 1x assay buffer kedalam vial yang berisi 1 mg trolox stok 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2carboxylic acid
sehingga diperoleh konsentrasi 1,5 mM trolox siap pakai.
Persiapan ABTS substrate solution
ABTS substrate solution dibuat dari satu 10 mg tablet ABTS 2,2’-azino-bis3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid dan satu tablet Phosphate citrate buffer pH 5 dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml kemudian ditepatkan dengan aqua bidestilata. Larutan
tersebut dikocok hingga rata.
35
Pembuatan kurva standar dan analisis sampel
Analisis total antioksidan dengan menggunakan antioksidant assay kit menggunakan prinsip terbentuknya senyawa radikal ferryl myoglobin dari metmyoglobin dan hidrogen peroksida,
yang mengoksidasi ABTS 2,2’-azino-bis3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid membentuk
kation radikal ABTS
.+
yang berwarna hijau. Pembuatan kurva standar mula-mula dengan membuat trolox standar dengan menambahkan berturut-turut 0, 5, 15, 35, 70, 140 µl trolox
working solution 1,5 mM dengan berturut-turut 500, 495, 485, 465, 430, 360 µl 1x assay buffer. Pembuatan larutan ini menghasilkan konsentrasi trolox standar 0 0,015 0,045 0,105
0,210 0,420 mM . Setelah pembuatan trolox standar langkah selanjutnya adalah pembuatan ABTS substrate
working solution yaitu dengan menambahkan 25 µl 3 hidrogen peroksida dengan 10 ml ABTS substrate solution. Sebanyak 10 µl trolox standar yang telah dibuat dimasukkan ke
dalam plate ELISA 96 sumur sebanyak dua kali ulangan. Kemudian ke dalam plate yang telah berisi trolox standar ditambahkan 20 µl myoglobin working solution. Hal yang sama juga
dilakukan terhadap sampel plasma dan serum. Kemudian ke dalam plate yang telah berisi trolox standar atau sampel yang telah diberi myoglobin working solution ditambahkan 150 µl
ABTS substrate working solution ke dalam setiap sumur. Setelah diinkubasi selama lima menit pada suhu ruang ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 100 µl stop solution. Langkah
terakhir adalah pembacaan absorbansi dengan ELISAplate reader pada panjang gelombang 405 nm. Konsentrasi antioksidan diperoleh dari perhitungan sebagai berikut.
XmM =
� � 405 − � � �
� �
� � �� � Keterangan:
XMm = konsentrasi antioksidan relatif terhadap trolox standar Y A 405 nm
= Absorbansi
c. Analisis kapasitas antioksidan eritrosit dengan DPPH Kubo
