dibuat berdasarkan jumlah sekuen DNA sederhana yang berulang-ulang. Single Nucleotide Polymorphism SNP adalah variasi sekuens tunggal DNA dalam
genom, yang biasanya terdapat dua alel di alam sehingga sangat mudah dianalisis. SNP menunjukkan tempat sekuens DNA yang dibedakan oleh satu basa dan
berperan penting dalam mekanisme molekuler terkait suatu karakter Kumar et al. 2012. Berbagai marka molekuler berbasis PCR telah digunakan untuk keragaman
genetik kelapa namun informasi genetik berdasarkan marka SSR dan SNAP masih kurang, khususnya untuk populasi kelapa Indonesia. Pada penelitian ini marka
tersebut dipilih untuk analisis keragaman genetik dan penentuan identitas kelapa hibrida karena jumlahnya yang melimpah dan terdistribusi merata dalam genom
tanaman, dihasilkan cepat melalui teknik PCR, mudah diskor dan informasi sekuen primernya mudah diakses melalui publikasi Govindaraj et al. 2015.
Marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD dan ABI3 belum pernah digunakan dalam riset pada populasi kelapa Indonesia. Gen WRKY merupakan
faktor transkripsi, secara langsung berperan dalam respon cekaman biotik dan
abiotik tanaman seperti senesen, pertumbuhan tanaman, dan pembentukan embrio Eulgem et al. 2000; Zhang dan Wang 2005. Gen SUS Sucrose Synthase,
SACPD Stearoyl Acyl Carrier Protein Desaturase dan
ABI Abscisic Acid
Insensitive berperan pada saat perkecambahan embrio. Selama perkecambahan
embrio, energi dan nutrisi diperoleh dari air kelapa sukrosa dan endosperma karbodiratgalaktomanan dan lipid. Gen SUS berperan dalam pembentukan
sukrosa sedangkan gen SACPD untuk pembentukan asam lemak, dengan mengubah asam stearat menjadi asam oleat Kachroo et al. 2008. Gen ABI
berperan dalam pergerakan galaktomanan yang terakumulasi di dinding sel endosperma Potomati dan Buckeridge 2002.
Kemampuan primer SNAP dievaluasi untuk menghasilkan marka SNAP. Evaluasi efektivitas primer SNAP menggunakan teknik multiplex PCR untuk
meningkatkan kecepatan dan efisiensi genotyping SNP. Multiplex PCR terdiri dari dua atau lebih pasang primer dalam satu campuran reaksi PCR untuk
menghasilkan beberapa ukuran amplikon yang spesifik Liu dan Wu 2012. Keunggulan teknik multiplex PCR adalah mengurangi biaya, waktu dan tenaga.
Namun ada kendala teknik multiplex PCR pada tanaman yaitu ukuran genom tanaman yang besar dan poliploidi, interaksi primer yang tidak diinginkan, dan
amplifikasi yang tidak spesifik Hayden et al. 2008. Selain itu menurut Sheng et al. 2003 masalah lainnya yaitu terbatasnya lokus target yang dapat diamplifikasi
dan kesulitan mendapatkan kembali hasil yang sama.
Program pemuliaan memiliki peranan penting untuk meningkatkan potensi kelapa sebagai komoditas komersial melalui perbaikan genetik kelapa. Langkah
pertama untuk skema peningkatan genetik kelapa adalah peta pautan genetik. Rohde et al. 1999 pertama kali mengonstruksi peta pautan genetik kelapa untuk
analisis QTL. Herran et al. 2000 menggunakan populasi persilangan antara kelapa Dalam Laguna dari Filipina dengan kelapa Genjah Kuning Malaysia untuk
membuat peta pautan dan mengidentifikasi QTL dengan karakter kecepatan perkecambahan. Selain itu peta pautan juga telah dikonstruksi oleh Lebrun et al.
2001 menggunakan populasi persilangan kelapa Genjah Merah Kamerun dengan kelapa Dalam di pulau Rennell Kepulauan Solomon untuk karakter produksi
menggunakan 96 marka AFLP dan 24 marka SSR. Untuk memetakan lokus-lokus terpaut dengan sifat khusus, digunakan peta pautan genetik yang tersusun atas
marka DNA. Marka SSR dan SNAP sangat sesuai untuk pembuatan peta pautan genetik karena bersifat ko-dominan, lebih mudah ditransfer dan lebih bermakna
dibanding marka yang dominan Yan et al. 2013.
Integrasi marka molekuler ke dalam program marker assisted selection MAS diketahui mampu meningkatkan efektivitas seleksi. Lokus DNA yang
berasosiasi dengan komponen produksi dan mempunyai pengaruh genetik yang besar akan bermanfaat untuk meningkatkan efektifitas seleksi Lebrun et al. 2001.
Salah satu cara untuk mengidentifikasi keberadaan QTL yang terkait dengan suatu karakter fenotipik adalah analisis marka tunggal Champoux et al. 1995; Collard
et al. 2005.
Teknik yang merupakan kombinasi seleksi berbasis marka molekuler dengan teknik pemuliaan konvensional merupakan alat bantu strategis yang dapat
mempersingkat waktu seleksi, sehingga dapat mempercepat pencapaian tujuan pemuliaan tanaman, untuk menyediakan sumberdaya genetik yang memiliki
karakter unggul dalam waktu yang singkat.
1.2 Perumusan Masalah
Plasma nutfah kelapa merupakan sumber sifat keturunan untuk merakit dan mengembangkan kultivar kelapa unggul. Evaluasi keragaman genetik koleksi
plasma nutfah kelapa Indonesia perlu dilakukan untuk memperoleh informasi genetik dalam menunjang program pemuliaan dan pelestarian plasma nutfah
kelapa Indonesia. Pengembangan marka molekuler untuk analisis keragaman genetik inter dan intra populasi kelapa Indonesia koleksi Balit Palma Manado
telah banyak dilakukan namun masih terbatas untuk aksesi tertentu. Untuk memperkaya informasi genetik plasma nutfah kelapa di Balit Palma Manado
maka dilakukan analisis keragaman genetik dengan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD, ABI3 dan marka SSR untuk 28 aksesi kelapa Dalam dan
13 aksesi kelapa Genjah.
Kelapa hasil persilangan terkontrol perlu diidentifikasi secara genetik untuk memastikan kebenaran tetuanya, karena kontaminasi serbuk sari dapat berpotensi
menjadi masalah. Penggunaan marka molekuler mampu mendeteksi keragaman genetik aksesi dan menduga kebenaran tetuanya. Oleh karena itu dilakukan
analisis dengan marka SSR untuk populasi KHINA-1, marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD, ABI3 dan marka SSR untuk persilangan kelapa kopyor
yang dilakukan di Pati dan Lampung. Individu KHINA-1 yang teridentifikasi sebagai legitimate hybrid dilanjutkan pengamatan di lapang. Parameter yang
diamati adalah jumlah buah per tandan dan komponen buah untuk analisis asosiasi antar marka SSR terhadap karakter jumlah buah dan komponen buah.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan umum penelitian ini adalah mendapatkan kandidat marka molekuler untuk analisis keragaman genetik kelapa Dalam dan Genjah, analisis hubungan
genetik kelapa hibrida dan analisis marka yang berasosiasi dengan karakter jumlah buah dan komponen buah. Adapun tujuan khusus penelitian adalah:
1. Mengembangkan marka SNAP berbasis gen WRKY dengan reaksi multiplex
PCR untuk analisis keragaman genetik inter dan intra populasi kelapa dan
penentuan identitas hibrida hasil persilangan beberapa varietas kelapa Indonesia;
2. Menganalisis keragaman genetik intra dan inter populasi plasma nutfah kelapa Indonesia menggunakan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS,
SACPD, ABI3 dan marka SSR; 3. Mendapatkan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD, ABI3 dan
marka SSR untuk penentuan identitas hibrida KHINA-1 dan kelapa kopyor; dan 4. Mendapatkan marka SSR yang berasosiasi dengan karakter jumlah buah dan
komponen buah kelapa.
1.4 Manfaat dan Kebaruan Penelitian
Manfaat dan kebaruan penelitian ini adalah: 1. Diperolehnya marka SNAP Single Nucleotide Amplified Polymorphism
berbasis gen WRKY dengan reaksi multiplex PCR, yang diaplikasikan untuk analisis keragaman genetik plasma nutfah kelapa;
2. Didapatkan metode reaksi multiplex PCR dengan marka SNAP gen WRKY, yang pertama kali digunakan untuk tanaman kelapa;
3. Informasi keragaman genetik 28 aksesi kelapa Dalam dan 13 aksesi kelapa Genjah berdasarkan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD dan
ABI3, informasi ini bermanfaat untuk menyusun program pemuliaan tanaman kelapa;
4. Informasi keragaman genetik 28 aksesi kelapa Dalam dan 13 aksesi kelapa Genjah berdasarkan marka SSR Simple Sequence Repeat, informasi ini
bermanfaat untuk menyusun program pemuliaan tanaman kelapa; 5. Informasi keragaman tetua yang digunakan untuk persilangan KHINA-1
Kelapa Hibrida Indonesia-1 dan hubungan genetik antara KHINA-1 dengan tetua berdasarkan marka SSR, informasi ini bermanfaat untuk mendapatkan
individu KHINA-1 yang illegitimate dan legitimate hybrid;
6. Diperolehnya marka SSR yang berasosiasi dengan karakter jumlah buah dan komponen buah KHINA-1 sehingga dapat dijadikan sebagai alat untuk seleksi
berbasis marka Marker Assisted Selection atau MAS, yang dapat mempersingkat waktu pemuliaan kelapa;
7. Informasi identitas hibrida kelapa kopyor berdasarkan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD dan ABI3 dan marka SSR, untuk mengetahui
keberhasilan persilangan terkontrol yang dilakukan di Pati dan Lampung.
1.5 Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian menggunakan plasma nutfah kelapa Indonesia terdiri dari lima kerangka utama penelitian. Pertama, pengembangan marka SNAP berbasis gen
WRKY yang divalidasi menggunakan reaksi multiplex PCR. Marka SNAP yang diperoleh diaplikasikan untuk analisis keragaman genetik dan identifikasi hibrida.
Kedua, mempelajari keragaman genetik aksesi kelapa koleksi Balit Palma Manado dengan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD, ABI3 dan
marka SSR. Ketiga, mengetahui hubungan genetik antar tetua dengan progeni dari persilangan kelapa GKN x DTA yaitu KHINA-1 berdasarkan marka SSR.
Keempat, mengidentifikasi marka SSR yang berasosiasi dengan karakter jumlah
buah dan komponen buah dari legitimate hybrid KHINA-1. Kelima, mengetahui identitas hibrida dari persilangan kelapa kopyor dengan kelapa unggul nasional
DTA, DTE, DMT, GSK berdasarkan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD, ABI3 dan marka SSR. Untuk mendefinisikan batasan penelitian ini
secara skematis disajikan dalam kerangka penelitian seperti
Gambar 1.1 .
Gambar 1.1 Diagram alir penelitian
1.6 Kerangka Berpikir dan Garis Besar Disertasi
Keragaman genetik plasma nutfah kelapa yang ada di Indonesia sangat tinggi, sebagian besar populasi tersebut telah dikoleksi oleh Balit Palma Manado.
Akan tetapi informasi genetik untuk semua aksesi kelapa belum lengkap. Beberapa penelitian telah dilakukan oleh peneliti Balit Palma Manado meliputi
analisis keragaman morfologi dan genetik secara terbatas pada beberapa aksesi kelapa tertentu menggunakan jumlah sampel dan aksesi yang terbatas, misalnya
hanya 2
–5 individu setiap aksesi. Informasi keragaman genetik tanaman kelapa koleksi Balit Palma menjadi penting dalam strategi pemuliaan tanaman kelapa.
II. Keragaman Genetik Berdasarkan Marka SNAP
SSR
~ [Bab 4 5]
III. Identifikasi Tetua Persilangan KHINA-1 Berdasarkan Marka SSR
dan Persilangan Kelapa Kopyor Berdasarkan Marka SNAP SSR
~ [Bab 6 8]
IV. Identifikasi Marka SSR yang Berasosiasi dengan Karakter
Jumlah Buah dan Komponen Buah ~ [Bab 7]
I. Pengembangan Marka SNAP Berbasis Gen WRKY
~ [Bab 3] PLASMA NUTFAH KELAPA INDONESIA
Marka Polimorfik untuk Keragaman Genetik, Penentuan Identitas Hibrida, dan Marka yang Berasosiasi dengan Karakter Jumlah Buah
dan Komponen Buah
Selain itu informasi hubungan genetik kelapa hasil persilangan terkontrol perlu diidentifikasi untuk memastikan kebenaran tetuanya, karena kontaminasi serbuk
sari dapat berpotensi menjadi masalah. KHINA-1 yang merupakan hasil persilangan antar kelapa Genjah Kuning Nias GKN dan Dalam Tenga DTA
belum pernah dianalisis hubungan genetik dengan tetuanya. Individu KHINA-1 yang tidak memiliki hubungan genetik dengan tetuanya tidak dapat digunakan
untuk tahapan seleksi. Setelah diperoleh informasi individu yang diduga merupakan progeninya maka dilanjutkan dengan pengamatan jumlah buah dan
komponen buah untuk menentukan marka-marka yang berasosiasi dengan karakter tersebut. Untuk hasil persilangan kelapa koypor di Pati dan Lampung
dilakukan analisis pola segregasi antara buah kelapa fenotipe normal dengan buah kelapa kopyor. Jumlah progeni yang digunakan sangat sedikit untuk persilangan
yang dilakukan di Lampung karena saat penelitian dilakukan masih sedikit buah yang berkecambah. Dengan demikian untuk melengkapi informasi hubungan
genetik plasma nutfah kelapa maka dilakukan serangkaian penelitian terkait aspek pemuliaan dan molekuler untuk menjawab permasalahan yang ada dan disajikan
dalam disertasi ini Gambar 1.1. Bab 1 diuraikan tentang latar belakang, masalah, tujuan, manfaat, kebaruan penelitian, ruang lingkup penelitian, kerangka berpikir
dan garis besar disertasi. Bab 2 berisi kajian literatur tentang keanekaragaman dan pemuliaan tanaman kelapa serta marka molekuler. Selain itu juga diuraikan hasil
penelitian yang terkait dengan beberapa aspek yang diteliti pada disertasi ini.
Perkembangan teknologi molekuler DNA telah banyak dimanfaatkan untuk mendukung program pemuliaan pada banyak spesies tanaman. Single Nucleotide
Amplified Polymorphisms SNAP adalah salah satu teknologi marka molekuler untuk mendeteksi putatif SNP menggunakan primer alel spesifik. Pengembangan
marka molekuler SNAP berbasis gen WRKY membutuhkan informasi struktur dan keragaman nukleotida dari gen pengendali sifat yang diinginkan. Informasi
tersebut didapatkan melalui data di GenBank untuk mendisain primer. Tahapan disain primer SNAP gen WRKY dan validasinya menggunakan reaksi multiplex
PCR disajikan di Bab 3. Reaksi multiplex dioptimasi terlebih dahulu untuk mendapatkan hasil yang optimum. Primer-primer yang diperoleh selanjutnya
diaplikasikan pada penelitian keragaman genetik kelapa dan identifikasi tetua KHINA-1 dan kelapa kopyor.
Primer SNAP gen WRKY kemudian digunakan untuk analisis keragaman genetik dan struktur populasi tanaman kelapa Dalam dan Genjah dengan reaksi
multiplex PCR. Selain berbasis gen WRKY juga digunakan gen SUS, SACPD dan ABI3 untuk melengkapi informasi keragaman genetik kelapa. Total jumlah
individu yang digunakan pada penelitian ini yaitu 507 individu sehingga untuk efisiensi penelitian waktu dan biaya maka metode reaksi multiplex PCR ini
dilakukan. Namun, metode ini dilakukan bila perbedaan ukuran produk PCR lebih dari 30 pasangan basa nukleotida pb, sehingga untuk gen SUS, SACPD dan
ABI3 metode ini tidak dapat digunakan karena ukuran produk PCR masing- masing gen sangat dekat atau kurang dari 30 pb. Topik yang membahas tentang
penelitian ini disajikan pada Bab 4. Untuk penggunaan marka SSR, metode reaksi multiplex PCR tidak dilakukan karena tidak dioptimasi.
Analisis keragaman genetik dan struktur populasi tanaman kelapa juga dilakukan menggunakan 20 marka SSR. Marka SSR dipilih untuk melengkapi
informasi genetik kelapa menggunakan marka multialel. Marka SSR yang
