agarosa gel, perbedaannya paling sedikit berkisar lebih dari 30 pb atau kurang dari 300 pb, sebaliknya maka diperlukan sistem elektroforesis kapiler resolusi tinggi,
misalnya QIAxcel atau sekuenser DNA yang memungkin separasi fragmen yang hanya berselisih kecil 1
–20 pb.
Gambar 3.4 Optimasi volume primer untuk multiplex PCR pada kelapa Kopyor Dalam Kalianda menggunakan primer WRKY22 260 pb dan
WRKY61 107 pb; volume primer 0.75 µL A and 0.375 µL B; suhu annealing adalah 55.4
o
C Multiplex PCR mempunyai banyak keuntungan, walaupun teknik tersebut
juga memiliki kelemahan yang tidak dapat dipungkiri, terutama adanya penghambatan antar set pasangan primer yang berbeda, efisiensi amplifikasi yang
rendah, dan kurang efisien yang mirip pada DNA template yang berbeda. Hal ini akan membatasi pengembangan yang maju dan terapan yang meluas Xu et al.
2012.
3.3.4 Validasi Multiplex PCR untuk Menghasilkan Marka SNAP
Untuk evaluasi efisiensi PCR dengan kombinasi beberapa primer, multiplex PCR dilakukan setelah diperoleh suhu annealing dan volume primer yang
optimum. Hasil optimasi multiplex PCR divalidasi menggunakan DNA genom kelapa kopyor Pati dan Jember dengan dua pasang primer duplex PCR dan tiga
pasang primer triplex PCR.
Amplifikasi DNA kelapa kopyor Pati menggunakan dua pasang primer WRKY61 [107 pb] dan WRKY22 [260 pb]; WRKY61 107 pb dan
WRKY21 319 pb; dan tiga pasang primer WRKY61 [107 pb], WRKY22 [260 pb] dan WRKY21 [319 pb]; WRKY61 107 pb, WRKY211 272 pb
dan WRKY71 354 pb dapat dilihat pada Gambar 3.5. Amplifikasi DNA pada sumur M2-4 dengan primer WRKY61 Alt 107 pb dan
WRKY21 Alt 319 pb, primer WRKY21 Alt 319 pb tidak menghasilkan produk PCR, hal ini diduga
pada sampel tersebut dengan lokus WRKY21 memiliki alel homozigot karena hanya salah satu alel yang bisa menghasilkan produk PCR. Untuk sumur M3-1
dan M3-2 menggunakan tiga pasang primer yaitu WRKY61 [107 pb], WRKY22 [260 pb] dan WRKY21 [319 pb] tetapi hanya dua primer yang dapat
mengamplifikasi DNA template. Primer WRKY21 [319 pb] tidak dapat mengamplifikasi DNA sehingga perlu dioptimasi lagi komponen reaksi PCR jika
menggunakan tiga pasang primer dalam satu reaksi PCR.
Pengujian reaksi duplex dan triplex PCR menggunakan DNA pool juga menunjukkan hasil yang sama. Reaksi triplex PCR dengan DNA pool hanya
menunjukkan adanya dua fragmen DNA Gambar 3.5. Dengan demikian, reaksi
1000 pb 500
400 300
200 100
M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
A B
260 pb 107
multiplex PCR yang dapat diperoleh dengan komponen reaksi PCR yang digunakan adalah reaksi duplex PCR.
Gambar 3.5 Amplifikasi primer SNAP untuk multiplex pada kelapa Kopyor Genjah Pati. Reaksi duplex PCR, M2-1: WRKY61 Alt 107 pb dan
WRKY22 Alt 260 pb; M2-2: WRKY61 Alt 107 pb dan WRKY22 Alt 260 pb; M2-3: WRKY61 Ref 107 pb dan WRKY21 Ref 319
pb; M2-4: WRKY61 Alt 107 pb dan WRKY21 Alt 319 pb. Reaksi triplex PCR menggunakan WRKY61 Ref 107 pb, WRKY22 Ref
260 pb dan WRKY21 Ref 319 pb, M3-2: WRKY61 Alt 107 pb, WRKY22 Alt 260 pb dan WRKY21 Alt 319 pb; M3-3: WRKY61
Ref 107 pb, WRKY211 Ref 272 pb dan WRKY71 354 pb Ref; M3-4: WRKY61 Alt 107 pb, WRKY211 Alt 272 pb dan
WRKY71 Alt 354 pb. Fragmen berukuran 354 pb tidak diperoleh
3.3.5 Aplikasi Duplex PCR untuk Aksesi Kelapa Kopyor
Reaksi duplex PCR diuji menggunakan 15 individu kelapa Genjah kopyor Pati dan kelapa Dalam kopyor Jember dengan pasangan primer WRKY63 352
pb dan WRKY191 211 pb; WRKY61 107 pb dan WRKY22 260 pb. Fragmen DNA dinilai berdasarkan ada atau tidak ada pita pada dua reaksi PCR
dari setiap pasang primer. Marka SNAP bersifat heterozigot bila kedua pasang primer mengamplifikasi fragmen DNA, tetapi bersifat homozigot bila hanya
sepasang primer yang mengamplifikasi fragmen DNA. Jika kedua pasang primer tidak mengamplifikasi fragmen DNA, maka marka SNAP tidak bersifat bi-alel.
Amplifikasi DNA kelapa kopyor Pati dengan primer WRKY63 352 pb dan WRKY191 211 pb menghasilkan fragmen yang jelas untuk semua sampel
yang diuji, hal ini menyatakan bahwa lima belas sampel tersebut memiliki alel heterozigot Gambar 3.6ab. Pada kelapa kopyor Jember terdapat dua sampel
yaitu nomor 1 dan 6 yang memiliki alel homozigot, untuk sampel nomor 1 pada lokus WRKY191 sedangkan sampel nomor 6 berada pada lokus WRKY63.
Sampel nomor 2-5 dan 7-15 memiliki alel heterozigot karena alel reference dan alel alternate dapat teramplifikasi dengan baik Gambar 3.6cd.
319 pb 272; 260
107
1000 pb 500
100
M M2-1 M2-2 M2-3 M2-4 M3-1 M3-2 M3-3 M3-4 Duplex Triplex
