Optimasi Multiplex PCR Hasil dan Pembahasan .1 Disain Primer SNAP

multiplex PCR yang dapat diperoleh dengan komponen reaksi PCR yang digunakan adalah reaksi duplex PCR. Gambar 3.5 Amplifikasi primer SNAP untuk multiplex pada kelapa Kopyor Genjah Pati. Reaksi duplex PCR, M2-1: WRKY61 Alt 107 pb dan WRKY22 Alt 260 pb; M2-2: WRKY61 Alt 107 pb dan WRKY22 Alt 260 pb; M2-3: WRKY61 Ref 107 pb dan WRKY21 Ref 319 pb; M2-4: WRKY61 Alt 107 pb dan WRKY21 Alt 319 pb. Reaksi triplex PCR menggunakan WRKY61 Ref 107 pb, WRKY22 Ref 260 pb dan WRKY21 Ref 319 pb, M3-2: WRKY61 Alt 107 pb, WRKY22 Alt 260 pb dan WRKY21 Alt 319 pb; M3-3: WRKY61 Ref 107 pb, WRKY211 Ref 272 pb dan WRKY71 354 pb Ref; M3-4: WRKY61 Alt 107 pb, WRKY211 Alt 272 pb dan WRKY71 Alt 354 pb. Fragmen berukuran 354 pb tidak diperoleh

3.3.5 Aplikasi Duplex PCR untuk Aksesi Kelapa Kopyor

Reaksi duplex PCR diuji menggunakan 15 individu kelapa Genjah kopyor Pati dan kelapa Dalam kopyor Jember dengan pasangan primer WRKY63 352 pb dan WRKY191 211 pb; WRKY61 107 pb dan WRKY22 260 pb. Fragmen DNA dinilai berdasarkan ada atau tidak ada pita pada dua reaksi PCR dari setiap pasang primer. Marka SNAP bersifat heterozigot bila kedua pasang primer mengamplifikasi fragmen DNA, tetapi bersifat homozigot bila hanya sepasang primer yang mengamplifikasi fragmen DNA. Jika kedua pasang primer tidak mengamplifikasi fragmen DNA, maka marka SNAP tidak bersifat bi-alel. Amplifikasi DNA kelapa kopyor Pati dengan primer WRKY63 352 pb dan WRKY191 211 pb menghasilkan fragmen yang jelas untuk semua sampel yang diuji, hal ini menyatakan bahwa lima belas sampel tersebut memiliki alel heterozigot Gambar 3.6ab. Pada kelapa kopyor Jember terdapat dua sampel yaitu nomor 1 dan 6 yang memiliki alel homozigot, untuk sampel nomor 1 pada lokus WRKY191 sedangkan sampel nomor 6 berada pada lokus WRKY63. Sampel nomor 2-5 dan 7-15 memiliki alel heterozigot karena alel reference dan alel alternate dapat teramplifikasi dengan baik Gambar 3.6cd. 319 pb 272; 260 107 1000 pb 500 100 M M2-1 M2-2 M2-3 M2-4 M3-1 M3-2 M3-3 M3-4 Duplex Triplex Gambar 3.6 Variabilitas kelapa kopyor Genjah Pati A dan B dan kelapa kopyor Dalam Jember C and D berdasarkan duplex PCR dari dua lokus marka SNAP. Gambar A dan C menggunakan primer WRKY63Ref [352 pb] dan WRKY191Ref [211 pb], sedangkan B dan D menggunakan primer WRKY63Alt [353 pb] dan WRKY191Alt [210 pb]. No.1-15: nomor sampel kelapa Kopyor yang digunakan. M: 100 pb DNA ladder Fragmen DNA yang dihasilkan dari primer WRKY61 107 pb dan WRKY22 260 pb menggunakan DNA kelapa kopyor Pati dan Jember menunjukkan hasil yang berbeda. Untuk kelapa kopyor Pati terdapat tiga sampel yang memiliki alel homozigot yaitu sampel nomor 3, 5 dan 7. Ketiga sampel tersebut memiliki alel homozigot pada lokus WRKY61, sedangkan sampel yang lain memiliki alel heterozigot. DNA kelapa kopyor Jember yang diamplifikasi dengan primer WRKY61 107 pb dan WRKY22 260 pb menghasilkan fragmen yang sama, hal ini berarti bahwa lima belas sampel yang digunakan memiliki alel heterozigot Gambar 3.7. Validasi primer SNAP pada tanaman pisang Klutuk Wulung dan Barangan juga menunjukkan adanya alel homozigot dan heterozigot Sutanto et al. 2013. 353 pb 210 1000 pb 500 100 352 pb 211 1000 pb 500 100 1000 pb 500 100 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 352 pb 211 353 pb 210 1000 pb 500 100 A B C D Ref Alt Ref Alt Gambar 3.7 Variabilitas kelapa Kopyor Genjah Pati A dan B dan kelapa Kopyor Dalam Jember C and D berdasarkan duplex PCR dari dua lokus marka SNAP. Gambar A dan C menggunakan primer WRKY61Ref 107 pb dan WRKY22Ref 260 pb, B dan D menggunakan primer WRKY61Alt 107 pb dan WRKY22Alt 260 pb. No.1-15: nomor sampel kelapa Kopyor. M: 100 pb DNA ladder

3.4 Simpulan

Berdasarkan 35 data sekuens gen WRKY di GenBank NCBI, dapat mendisain 8 primer SNAP gen WRKY untuk gen WRKY2, WRKY6, WRKY7, WRKY19 dan WRKY21. Kedelapan primer berhasil diuji dengan reaksi singleplex PCR, yang hasilnya menjadi acuan untuk validasi reaksi multiplex PCR. Reaksi multiplex PCR yang berhasil diperoleh adalah reaksi duplex PCR dan telah diaplikasikan untuk kelapa kopyor Pati dan Jember. 1000 pb 500 100 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 260 pb 107 1000 pb 500 100 1000 pb 500 100 1000 pb 500 100 260 pb 107 260 pb 107 260 pb 107 A B C D Ref Alt Ref Alt