Gambar 3.1 Multiple sequence alignment dari gen WRKY6 pada kelapa menunjukkan adanya posisi Single Nucleotide Polymorphisms SNP
pada posisi ke-3 di ukuran basa 795 dari sekuens. Variasi nukleotida sebesar berturut-turut untuk T 57.1 atau C 42.9
Tabel 3.2 Daftar titik SNP berdasarkan multiple sequence alignment gen WRKY dari tanaman kelapa
Gen WRKY Letak SNP
a
Alternatif bi-alel SNP
b
Rasio alel SNP
c
WRKY2 1
2 697
721 AG
GC 68
78 WRKY6
1 3
156 795
CT TC
67 47
WRKY7 1
561 TA
56 WRKY19
1 74
GA 67
WRKY21 1
3 447
553 GC
AG 57
67
Keterangan:
a
X Y = mengindikasikan urutan titik SNP X dari gen WRKY yang terdapat pada
nomor basa tertentu setelah dilakukan MSA Y;
b
XY = mengindikasikan alel mayor X dan alel minor Y;
c
XY = mengindikasikan rasio alel mayor terhadap total jumlah SNP dari fragmen yang dievaluasi.
3.3.1.3 Disain primer SNAP berdasarkan SNP
Kriteria untuk mendisain primer SNAP, di sekitar situs SNP terdapat minimal 25 basa. Hal ini untuk memenuhi panjang oligonukleotida sebagai primer
yang sesuai untuk PCR, terutama pada situs SNP di ujung 5’ dan 3’ runutan
fragmen DNA. Kriteria yang sama juga menjadi syarat dalam mendisain primer dCAPS menggunakan perangkat lunak dCAPS Finder Shahinnia dan Sayed-
Tabatabaei 2009.
Disain primer SNAP menggunakan hasil multiple sequence alignment untuk fragmen gen WRKY diajukan secara online submit sekuensnya menggunakan
piranti lunak online http:ausubellab.mgh.harvard.edu. Setiap submit hanya mendefinisikan satu titik SNP, sehingga untuk titik SNP lain maka submit
dilakukan berulang. Disain primer dari satu titik SNP menggunakan piranti lunak WebSNAPER diperoleh beberapa alternatif pasangan primer untuk menghasilkan
marka SNAP. Pemilihan pasangan primer dilakukan dengan memperhatikan beberapa hal yaitu suhu Tm tidak jauh berbeda dan posisi mismatch berada pada
satu sampai empat nukleotida dari situs SNP Sutanto et al. 2013. Posisi mismatch adalah satu nukleotida yang berbeda selain pada situs SNP dari primer
forward terhadap sekuen aslinya. Posisi mismatch dari ujung 3’ sangat
berpengaruh terhadap keberhasilan amplifikasi DNA Bru et al. 2008. Semakin dekat mismatch
dengan ujung 3’ semakin besar kegagalan mendapatkan produk PCR. Berdasarkan hal tersebut, primer SNAP yang dipilih adalah primer dengan
posisi mismatch paling jauh dari ujung 3’.
Setiap situs SNP diperlukan dua pasangan primer, pasangan pertama primer forward dan reverse untuk alel referensi sedangkan pasangan kedua primer
forward dan reverse untuk alel alternatif. Dengan demikian, dari delapan situs SNP dihasilkan 16 pasang primer SNAP terpilih seperti yang ditampilkan pada
Tabel 3.3.
Tabel 3.3 Daftar primer SNAP yang didisain berdasarkan gen WRKY
No Id primer
Sekuens primer Panjang
primer Tm
°C Ukuran
pb 1
WRKY21Ref TCAAAAGTCGTACGTGAACCACGGG
25 50.3 319
WRKY21Rev GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG
21 50.3
WRKY21Alt CATCAAAAGTCGTACGTGAACCAGGGA 27
50.3 321 2
WRKY22Ref TGATGATGGTTACCGCTGGGGG
22 55.4 260
WRKY22Rev GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG
21 55.4
WRKY22Alt TGATGATGGTTACCGCTGGGGC
22 55.4 260
3 WRKY61Ref
AAAATATAATTCAGGGAATTAAGCAG 26 48.8 107
WRKY61Rev AAAGTAGTGAAAGGGAATCCAAA
23 48.8
WRKY61Alt AAAATATAATTCAGGGAATTAAGCAA 26
48.8 107 4
WRKY63Ref ATAAATATCACATATCCCTGAGCAA
25 50.3 352
WRKY63Rev CTACAGGTATTGTTAAATGTGCCA
24 50.3
WRKY63Alt TATAAATATCACATATCCCTGAGCAG
26 50.3 353
5 WRKY71Ref
CATCCGATCATTCGTGCG 18
50.3 354 WRKY71Rev
ATCGATATCACTTGTGGTCTGAA 23
50.3 WRKY71Alt
CATCCGATCATTCGTGCC 18
50.3 354 6
WRKY191Ref CGTCTTCTGCAAACTAAGCTCA
22 52.6 211
WRKY191Rev ATGATATATATACAAGACTACGCCGAT 27
52.6 WRKY191Alt
GTCTTCTGCAAACTAAGCTCG 21
52.6 210 7
WRKY211Ref ATTGCCTATTAAAAATAACAATTTACG 27
52.6 272 WRKY211Rev
TACCATATATTAATGCGGATGAGAT 25
52.6 WRKY211Alt
ATTGCCTATTAAAAATAACAATTTACC 27 52.6 272
8 WRKY213Ref
AGCATCTTGATCAATTACGATACC 24
55.4 237 WRKY213Rev
TACCATATATTAATGCGGATGAGAT 25
55.4 WRKY213Alt
AAGCATCTTGATCAATTACGATACA 22
55.4 238
Keterangan: Ref = Reference; Rev = Reverse; Alt = Alternate
3.3.2 Validasi SNAP Menggunakan Reaksi Singleplex PCR
Kemampuan primer SNAP yang dikembangkan untuk menghasilkan marka SNAP perlu dievaluasi. Validasi primer SNAP dilakukan menggunakan DNA
