Marka Molekuler Keragaman Genetik Plasma Nutfah Kelapa Indonesia Dan Penentuan Identitas Kelapa Hibrida Berdasarkan Marka Molekuler

Daftar Pustaka [IPGRI] The International Board of Plant Genetic Resources Institute. 2003. Descriptores del ulluco Ullucus tuberosus. Roma, Italia IT: Instituto Internacional de Recursos Fitogeneticos Centro Internacional de la Papa. Agarwal M, Shrivastava N, Padh H. 2008. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27:617- 631. doi: DOI 10.1007s00299-008-0507-z. Amar MH, Biswas MK, Zhang Z, Guo WW. 2011. Exploitation of SSR, SRAP and CAPS-SNP markers for genetic diversity of citrus germplasm collection. Sci Hortic. 2011128:220-227. doi: 10.1016j.scienta.2011.01.021. Brumlop S, Finckh MR. 2011. Applications and potentials of marker assisted selection MAS in plant breeding. Bonn, Germany DE: Bundesamt für Naturschutz BfN Federal Agency for Nature Conservation. Champoux MC, Wang G, Sarkarung S, OToole JC, Huang N, McCouch SR. 1995. Locating genes associated with root morphology and drought avoidance in rice via linkage to molecular markers. Theor Appl Genet. 90:969-981. Chan E, Craig RE. 2006. Species profiles for pacific island agroforestry: Cocos nucifera L. Coconut. Hawai US: Traditional Tree Initiative - Permanent Agriculture Resources. Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK. 2005. An introduction to markers, quantitative trait loci QTL mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica. 2005142:169-196. doi: 10.1007s10681-005-1681-5. Devakumar K, Niral V, Jerard BA, Jayabose C, Chandramohanan R, Jacob PM. 2010. Microsatellite analysis of distinct coconut accessions from Agati and Kavaratti islands, Lakshadweep, India. Sci Hortic. 125:309-315. Direktorat Jenderal Perkebunan. 2015. Luas areal dan produksi perkebunan seluruh Indonesia. Diakses tanggal: Sep 05, 2015, Tersedia pada: http:ditjenbun.deptan.go.idcigraphindex.phpviewstatkomoditiutama5- Kelapa . Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, Somssich IE. 2000. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci. 5:199-206. Foale M. 1992. Coconut genetic diversity: present knowledge and future research needs. IPGRI Workshop on Coconut Genetic Resources in Cipanas, Indonesia, 8-11 Oct 1991, IPGRI Rome IT:46-55. Foale M. 2005. An introduction to the coconut palm. Coconut Genetic Resources. Batugal P, et al., editor. Selangor, Malaysia MY: International Plant Genetic Resources Institute:1-779. Ganal MW, Altmann T, Roder MS. 2009. SNP identification in crop plant. Curr Opin Plant Biol. 12:211-217. Govindaraj M, Vetriventham M, Srinivasan M. 2015. Importance of genetic diversity assesment in crop plants and its recent advances: an overview of its analytical perspectives. Genet Res Intl. 2015:1-14. doi: 10.11552015431487. Gupta PK, Roy JK, Prasad M. 2001. Single nucleotide polymorphism: a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plant. Curr Sci. 804:524-535. Hannum S, Hartana A, Suharsono. 2003. Kemiripan genetika empat populasi kelapa genjah berdasarkan pada Random Amplified Polymorphic DNA. Hayati. 104:125-129. Harries HC. 1978. The evolution, dissemination and classification of Cocos nucifera L. Bot Rev. 443:265-319. Hayati PKD, Hartana A, Suharsono, Aswidinoor H. 2000. Keanekaragaman genetika kelapa genjah jombang berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA. Hayati. 72:35-40. Hayden JM, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ. 2008. Multiplex-ready PCR: a new method for multiplexed SSR and SNP genotyping. BMC Genomics. 809:1-12. doi: 10.11861471-2164-9-80. Hayward AC, Tollenaere R, Morgan JD, Batley J. 2015. Molecular marker applications in plants. Plant Genotyping: Methods and Protocols. Batley J, editor. New York US: Springer Science Business Media. 1245:13-28. Herran A, Estioko L, Becker D, Rodriguez MJB, Rohde W. 2000. Linkage mapping and QTL analysis in coconut Cocos nucifera L.. Theor Appl Genet. 101:292-300. Herrera M, Alan W, James W, David N, Raymond J. 2007. Usefulness of WRKY gene-derived markers for assessing genetic population structure: an example with Florida coconut cultivars. Sci Hortic. 115:19-26. Hiremath PJ, Kumar A, Penmetsa RV, Farmer A, Schlueter JA, Chamarthi SK, Whaley AM, Carrasquilla ‐Garcia N, Gaur PM, Upadhyaya HD. 2012. Large ‐scale development of cost‐effective SNP marker assays for diversity assessment and genetic mapping in chickpea and comparative mapping in legumes. Plant Biotechnol J. 106:716-732. Idroes A. 2012. Coconut statistical yearbook. Indonesia ID: Asian and Pasific Coconut Community. Ifadatin S. 2002. Kemiripan genetik enam populasi kelapa dalam dari Kalimantan Barat berdasarkan penanda RAPD Random Amplified Polymorphic DNA. [Magister Thesis], Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Jihong H, Songtao G, Zhixuan Z, Xiaolei W, Weidong K, Yi D. 2015. Genome- wide identification of SSR and SNP markers based on whole-genome resequencing of a Thailand wild sacred lotus Nelumbo nucifera. Plos One. 2015:1-17. doi: 10.1371journal.pone.0143765. Kachroo A, Fu D-Q, Havens W, Navarre DR, Kachroo P, Ghabrial SA. 2008. An oleic acid –mediated pathway induces constitutive defense signaling and enhanced resistance to multiple pathogens in soybean. MPMI. 21:564-575. Kriswiyanti E, Temaja IGRM, Sudana IM, Wirya IGNAS. 2013. Genetic variation of coconut tall Cocos nucifera L., Arecaceae in Bali, Indonesia based on microsatellite DNA. J Biol Agric Healthcare. 313:97-101. Kumar S, Banks TW, Cloutier S. 2012. SNP discovery through next-generation sequencing and its applications. Intl J Plant Genomics. 2012:1-15. doi: doi:10.11552012831460. Kumar SP, Manimekalai R, Kumari BDR. 2011. Microsatellite marker based characterization of South Pasific coconut Cocos nucifera L. accessions. Intl J Plant Breed Genet. 51:34-43. Kumaunang J, Maskromo I. 2007. Keragaman genetik plasma nutfah kelapa Dalam Cocos nucifera L di kebun percobaan Mapanget berdasarkan penanda DNA SSRs. Buletin Palma. 33:18-27. Larekeng SH, Maskromo I, Purwito A, Mattjik NA, Sudarsono S. 2015. Pollen dispersal and pollination patterns studies in Pati kopyor coconut using molecular markers. Intl J Coconut Res Dev. 311:46-60. Lebrun P, Baudouin L, Bourdeix R, Konan JL, Barker JHA, Aldam C, Herran A, Ritter E. 2001. Construction of a linkage map of the Rennell Island Tall coconut type Cocos nucifera L. and QTL analysis for yield characters. Genome. 44:962-970. Li S, Wan H, Ji H, Zou K, Yang G. 2009. SNP discovery based on CATS and genotyping in the finless porpoise Neophocaena phocaenoides. Conserv Genet. 10:2013-2019. doi: 10.1007s10592-009-9882-4. Liu BH. 1998. Statistical genomics: Linkage, mapping and QTL analysis. Washington US: CRC Press. Liu L, Wu Y. 2012. Development of a genome-wide multiple duplex-SSR protocol and its applications for the identification of selfed progeny in switchgrass. BMC Genomics. 13522:1-13. Liyanage DV, Corputy CHP. 1976. Coconut germplasm in Indonesia. Pemberitaan LPTI. 21:12-30. Loiola CM, Azevedo AON, Diniz LEC, Aragão WM, Azevedo CDO, Santos PHAD, Ramos HCC, Pereira MG, Ramos SRR. 2016. Genetic relationships among tall coconut palm Cocos nucifera L. accessions of the international coconut genebank for Latin America and the Caribbean ICG-LAC, evaluated using microsatellite markers SSRs. Plos One. 113:1-11. doi: 10.1371journal.pone.0151309. Martial YSD, Louis KKJ, Désiré PN, Noel KKJ, Emmanuel IA, Sylvère SR, Arsène ZBI. 2013. Assessment of the genetic diversity conservation in three tall coconut Cocos nucifera L. accessions regenerated by controlled pollination, using microsatellite markers. African J Biotechnol. 1220:2808-2815. doi: 10.5897AJB11.3608. Maskromo I, Tenda TE, Tulalo MA, Novarianto H, Sukma D, Sukendah, Sudarsono. 2015. Keragaman fenotipe dan genetik tiga varietas kelapa genjah kopyor asal Pati Jawa Tengah [Fenotipic and genetic diversity of three Dwarf Kopyor coconut from Pati, Central Java, Indonesia] [in Indonesia]. J Littri. 21:1-8. Matondang I. 2000. Keragaman genetik kelapa dalam yang berasal dari Maluku berdasarkan penanda RAPD. [Magister Thesis], Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Mawikere NL. 2005. Plasma nutfah kelapa papua dan hubungan kekerabatannya dengan populasi kelapa Indonesia lainnya dan Papua New Guinea berdasarkan penanda RAPD. [Disertasi], Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Meerow AW, Wisser RJ, Brown JS, Kuhn DN, Schnell RJ, Broschat TK. 2003. Analysis of genetic diversity and population structure within Florida coconut Cocos nucifera L. germplasm using microsatellite DNA with special emphasis on the Fiji Dwarf cultivar. Theor Appl Genet. 106:715- 726. Meksem K, Kahl G. 2005. The handbook of plant genome mapping. KgaA, Weinheim DE: Wiley Verlag. Nagy ES. 1997. Frequency-dependent seed production and hybridization rates: Implications for gene flow between locally adapted plant populations. Evolution. 513:703-714. Novarianto H. 2008. Perakitan kelapa unggul melalui teknik molekuler dan implikasinya terhadap peremajaan kelapa di Indonesia [Assembling of superior coconut by molecular technique and its implication to coconut renewal in Indonesia] [in Indonesia]. Pengembangan Inovasi Pertanian. 14:259-273. Novarianto H. 2010. Karakteristik bunga dan buah hasil persilangan kelapa hibrida genjah x genjah. Buletin Palma. 39:100-110. Novarianto H, Miftahorachman. 2000. Koleksi dan konservasi jenis-jenis kelapa unik. Simposium pengelolaan plasma nutfah dan pemuliaan. Bandung ID, Perhimpunan Ilmu Pemuliaan Indonesia. Novarianto H, Rompas T, Darwis SN. 1998. Coconut breeding programme in Indonesia. Coconut breeding. Batugal PO, et al., editor. Serdang, Malaysia MY: IPGRI:2-41. Pandin DS. 2000. Kemiripan genetik populasi kelapa Dalam Mapanget, Tengah, Bali, Palu dan Sawarna berdasarkan penanda RAPD Random Amplified Polymorphic DNA. [Magister Thesis], Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Pandin DS. 2009. Keragaman genetik kultivar kelapa Dalam Mapanget DMT dan Dalam Tenga DTA berdasarkan penanda Random Amplified Polymorphic DNA RAPD. Buletin Palma. 36:17-29. Perera L. 2010. Hybrid testing and variety identification of coconut Cocos nucifera L. in Sri Lanka using microsatellite markers. Intl J Coconut R D. 261:39-43. Perera L, Russel J, Provan J, Powell W. 2000. Studying genetic relationship among coconut varietiespopulations using microsatellite markers. Euphytica. 132:121-128. Pesik A, Efendi D, Novarianto H, Dinarti D, Maskromo I, Tenda ET, Sudarsono. 2015. Keragaman dan hubungan genetik antara kelapa Genjah Kuning Nias GKN dan Dalam Tenga DTA serta Hibrida KHINA-1 berdasarkan marka mikrosatelit. Buletin Palma. 162:129-140. Peterson GW, Dong Y, Horbach C, Fu YB. 2014. Genotyping-by-sequencing for plant genetic diversity analysis: a lab guide for SNP genotyping. Diversity. 20146:665-680. doi: 10.3390d6040665. Potomati A, Buckeridge MS. 2002. Effect of abcisic acid on the mobilisation of galactomannan and embryo development of Sesbania virgata Cav. Pers. Leguminose-Faboideae. Revista Brasil Bot. 25:303-310. Rafalski A. 2012. Application of single nucleotide polymorphism in crop genetics. Curr Opin Plant Biol. 5:94-100. Rajesh MK, Arunachalam V, Nagarajan P, Lebrun P, Samsudeen K, Thamban C. 2008. Genetic survey of 10 Indian coconut landraces by simple sequence repeats SSRs. Sci Hortic. 118:282-287. Rajesh MK, Jerard BA, Preethi P, Thomas RJ, Fayas TP, Rachana KE, Karun A. 2013. Development of a RAPD-derived SCAR marker associated with tall-type palm trait in coconut. Sci Hortic. 150:312-316. doi: 10.1016j.scienta.2012.11.023. Rajesh MK, Samsudeen K, Jerard BA, Rejusha P, Karun A. 2014. Genetic and phylogenetic relationships of coconut populations from Amini and Kadmat Islands, Lakshadweep India. Emir J Food Agric. 2610:898-906. Ren J, Sun D, Chen L, You FM, Wang J, Nevo E, Sun D, Luo MC, Peng J, Peng Y. 2013. Genetic diversity revealed by single nucleotide polymorphism markers in a worldwide germplasm collection of durum wheat. Intl J Mol Sci. 14:7061-7088. doi: 10.3390ijms14047061. Reyne A. 1948. Kelapa. Yogyakarta ID: Lembaga Pendidikan Perkebunan LPP. Rivera R. 1999. Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in Cocos nucifera L. Genom. 42:668-675. Rohde W, Becker D, Kullaya A, Rodriguez J, Herran A. 1999. Analysis of coconut germplasm biodiversity by DNA marker technologies and construction of a genetic linkage map: Current advances in coconut biotechnology. Oropeza C, et al., editor. Dordrecht DE: Kluwer Academic Publishers:99-120. Rompas T. 1993. Beberapa kultivar kelapa yang potensial dikembangkan dan program hibridisasi. Prosiding Konferensi Nasional Kelapa III Yogyakarta ID, Balitbang Pertanian. Puslitbangtri. Roslim DI, Hartana A, Suharsono. 2003. Kemiripan genetika tiga populasi kelapa tipe dalam berdasarkan tiga metode analisis data penanda RAPD. Hayati. 10:12-18. Sangare A, Rognon F, de Nuce de Lamothe M. 1978. Male and female phases in the inflorescence of the coconut. Oleagineux. 3012:609-617. Santos GA. 1999. Potensial use of clonal propagation in coconut improvement program. Oropeza C, et al., editor. London UK: Kluwer Academic Publisher:419-430. Santos GA, Batugal PA, Othman A, Baudouin L, Labouisse JP. 1996. Manual on Standardized Research Techniques in Coconut Breeding: COGENT, IPGRI. Sheng ZL, Becquet V, Hua LS, Zhang D. 2003. Optimization of multiplex PCR and multiplex gel electrophoresis in sunflower SSR analysis using infrared flourescence and tailed primers. Acta Botanica Sinica. 4511:1312-1318. Sudarsono, Sudrajat, Novarianto H, Hosang M, Dinarti D, Rahayu MS, Maskromo I. 2012. Produksi bibit kopyor true to type dengan persilangan terkontrol dan peningkatan produksi buah kopyor dengan polinator lebah madu. Jakarta ID, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan RI. Tanksley SD. 1983. Molecular markers in plant breeding. Plant Mol Biol Reporter. 1:3-5. Teulat B, Aldam C, Trehin R, Lebrun R, Barker JHA, Arnold GM, Karp A, Baudouin L, Rognon F. 2000. An analysis of genetic diversity in coconut Cocos nucifera L. populations from across the geographic range using sequence-tagged microsatellites SSRs and AFLPs. Theor Appl Genet. 100:764-771. Vicente MC, Gusman FA, Engels J, Rao VR. 2005. Genetic characterization and its use in decision making for the conservation of crop germplasm. The role of biotechnology. Turin, Italy IT:121-128. Wen D, Zang C. 2012. Universal multiplex PCR: a novel method of simultaneous amplification of multiple DNA fragments. Plant Methods. 328:2-9. Xiao Y, Yi L, Yaodong Y, Haikuo F, Wei X, Annaliese M, Songlin Z, Ross S, Fei Q. 2013. Development of microsatellite markers in Cocos nucifera and their application in evaluating the level of genetic diversity of Cocos nucifera. Plant Omics J. 6:193-200. Yan J, Jing J, Mu X, Du H, Tian M, Wang S, Lu W, Bao Z. 2013. A genetic linkage map of the sea cucumber Apostichopus japonicus based on microsatellites and SNPs. Aquaculture. 404:1-7. doi: 10.1016j.aquaculture.2013.04.011. Zhang Y, Wang L. 2005. The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants. BMC Evol Biol. 51:1-12. 3 PENGEMBANGAN MARKA SNAP BERBASIS GEN WRKY DAN VALIDASI MENGGUNAKAN MULTIPLEX PCR 1 Abstrak Pengembangan marka molekuler memberikan manfaat bagi program pemuliaan kelapa. Ketersediaan sekuens DNA memberikan peluang baru untuk mengembangkan marka molekuler yaitu: single nucleotide amplified polymorphism SNAP. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi keragaman sekuens nukleotida gen WRKY di database GenBank, desain primer spesifik gen untuk membuat marka SNAP berdasarkan gen WRKY, optimasi teknik multiplex PCR, dan validasi efektivitas marka SNAP untuk evaluasi plasma nutfah kelapa Kopyor. Berdasarkan data 35 sekuens gen WRKY tanaman kelapa yang tersedia di database GenBank, delapan titik SNP diidentifikasi dan digunakan untuk menghasilkan primer spesifik SNP. Delapan pasang primer didisain dan divalidasi menggunakan singleplex PCR. Optimasi suhu Ta, konsentrasi primer, duplex dan triplex PCR dilakukan untuk multiplex PCR. Duplex PCR menggunakan dua pasang primer lebih sesuai untuk genotyping plasma nuftah kelapa kopyor dibandingkan triplex PCR. Duplex PCR telah berhasil diaplikasikan untuk kelapa Dalam Kopyor di Jember dan Kalianda, dan Genjah Kopyor di Pati. Pengembangan marka SNAP dapat digunakan sebagai alternatif sederhana marka ko-dominan untuk analisis genetik kelapa. Ketersediaan marka SNAP dapat digunakan untuk investigasi kemungkinan asosiasi antara marka dan endosperma Kopyor serta karakter fenotip penting lainnya pada tanaman kelapa. Kata kunci: Kelapa Kopyor, Multiplex PCR, SNP 1 Bab ini telah disubmit pada Emirates Journal Food and Agriculture 2016, dengan judul: “Development of SNAP Markers Based on Nucleotide Variability of WRKY Genes in Coconut and Their Validation Using Multiplex PCR ”. Abstract Development of molecular markers benefits coconut breeding program. Availability of DNA sequences for coconuts opens new possibility of developing molecular markers such as: single nucleotide amplified polymorphism SNAP. The study objectives are to evaluate nucleotide sequence diversities of WRKY gene in the GenBank database, design gene specific primers for generating WRKY specific SNAP markers, optimize multiplex PCR technique and validate SNAP marker effectiveness for evaluating Kopyor coconut germplasm. Based on 35 sequence data of coconut WRKY genes available in the GenBank database, eight informative SNPs were identified and used to generate SNP specific primers. Eight primer pairs were designed and validated using singleplex PCR. Subsequently, optimization of the Ta, primer concentrations, and either duplex or triplex PCR were evaluated. Duplex PCR using two sets of primer pairs was more reliable for genotyping Kopyor coconut germplasm than triplex PCR. Duplex PCR has successfully been demonstrated for genotyping Jember Tall, Kalianda Tall, and Pati Dwarf Kopyor coconuts. Therefore, the developed SNAP markers can be used as simple alternative of co-dominant markers for genetic analysis of coconuts. Availability of SNAP markers can be used to investigate possible association between markers and Kopyor endosperm and other important phenotypes in coconuts. Keywords: Kopyor coconut, Multiplex PCR, SNP

3.1 Pendahuluan

Kemajuan di bidang biologi molekuler dan bioteknologi telah memberikan banyak kesempatan dalam penelitian molekuler tanaman. Identifikasi dan sekuensing berbagai gen yang berbeda dari spesies tanaman telah dilakukan dan disimpan dalam database bank data NCBI http:www.ncbi.nlm.nih.gov. Kemudahan mengakses data akan mempercepat dan memberikan peluang pendekatan penelitian pada beragam tanaman, termasuk tanaman kelapa. Kelapa kopyor Indonesia merupakan hasil mutasi genetik alami, yang tersebar di beberapa daerah yaitu Banyuwangi, Jember, Lampung, Pati dan Sumenep, sehingga perlu diketahui keragaman genetik antar populasi tanaman dalam menunjang penyediaan benih. Seleksi plasma nutfah kelapa berdasarkan parameter morfologi dapat langsung dilihat dari beda ciri kualitatif dan kuantitatif, namun kurang akurat dan membutuhkan waktu yang lama untuk perakitan kelapa unggul, sehingga perlu didukung oleh marka molekuler Novarianto 2008. Tantangan utama para peneliti tanaman kelapa adalah memadukan teknik molekuler untuk memahami fungsi dan struktur genom sebagai ciri genetik. Hal ini memberikan kesempatan untuk mengembangkan marka molekuler yang tepat dan dapat diandalkan terutama gen-gen penting untuk perbaikan genetik tanaman. Strategi perbaikan tanaman yang efektif adalah menggunakan marka molekuler yang dikaitkan dengan karakter fenotipik yang diamati. Upaya yang dapat dilakukan adalah melibatkan hubungan polimorfisme sekuens DNA dengan fenotipe menggunakan peta pautan genetik atau studi asosiasi. Pada pendekatan awal, marka molekuler yang komprehensif perlu dikembangkan dengan meman- faatkan gen-gen yang telah dikarakterisasi. Pengembangan marka molekuler untuk mengidentifikasi genotipe secara cepat dan tepat, telah terbukti menjadi teknik yang efisien untuk karakterisasi dan koleksi plasma nutfah tanaman. Awalnya RAPD, RFLP, AFLP dan ISSR telah sering digunakan untuk karakterisasi varietas dan aksesi tanaman kelapa. Sejak marka-marka tersebut dapat digunakan tanpa membutuhkan informasi genom sebelumnya untuk analisis, maka umumnya marka itu digunakan sebagai marka pilihan. Namun, adanya pengembangan marka SNAP untuk berbagai tanaman, menjadikan marka ini lebih akurat untuk analisis keragaman genetik dan hubungan genetik Singh et al. 2013. Single Nucleotide Polymorphism SNP adalah variasi nukleotida tunggal DNA dalam genom, yang umum terdapat dua alel di alam sehingga mudah dianalisis. Polimorfisme satu nukleotida ditemukan sangat banyak, sehingga berpotensi sebagai marka yang tersebar di sepanjang genom tanaman Simko et al. 2012. Marka molekuler berbasis SNP telah digunakan untuk studi genotip Chagné et al. 2008; Bakooie et al. 2015, identifikasi varietas Fang et al. 2014; Olmos et al. 2015; Wang et al. 2015, pembuatan peta tautan genetik beresolusi tinggi dan seleksi untuk karakter tertentu Cho et al. 2011; Mammadov et al. 2012; Li et al. 2014. SNP menjadi marka pilihan untuk analisis keragaman genetik karena bersifat bi-alel dan terdapat dalam frekuensi tinggi dalam genom. Ketersediaan bentuk genotyping SNP akan berpengaruh pada penentuan genetik suatu karakter yang memiliki nilai ekonomi, yang digunakan untuk aplikasi marker assisted selection MAS dan seleksi genomik Ren et al. 2013. Frekuensi variasi SNP sangat bergantung pada jenis tanaman. Rasio SNP pada jagung ditemukan 1 SNP per 31 pb di bagian non-coding region dan 1 SNP per 124 pb di bagian coding region Ching et al. 2002 . Pada genom tanaman teh ditemukan 60 situs SNP Fang et al. 2014. Eulgem et al. 2000 melaporkan keberadaan 70 situs SNP pada genom Arabidopsis, sedangkan pada padi terdapat 109 situs SNP Zhang dan Wang 2005. Keberadaan SNP dapat ditemukan pada sekuen DNA tanaman kelapa pada gen WRKY. Faktor transkripsi WRKY sebagai protein superfamili yang mengandung satu atau dua daerah WRKY yang terkonservasi conserve region antar anggota kelompok WRKY. Sekuen asam amino terkonservasi pada WRKY, yaitu daerah WRKYGQK, yang merupakan asal penamaannya. Kelompok WRKY meningkat selama evolusi melalui duplikasi. Kelompok WRKY berperan dalam fungsi biologi tanaman, pertama kali dijelaskan oleh Eulgem et al. 2000 . WRKY secara langsung berperan dalam respon cekaman biotik dan abiotik tanaman seperti senesen, pertumbuhan tanaman, dan pembentukan embrio Eulgem et al. 2000; Zhang dan Wang 2005. Disain primer merupakan syarat awal untuk efisiensi teknik molekuler berbasis PCR. Primer oligonukleotida merupakan nukleotida pendek yang dapat berikatan dengan situs target pada cetakan DNA dalam reaksi rantai polimerisasi PCR secara in vitro. Pelekatan primer dengan situs target memicu reaksi enzim polimerase DNA untuk memanjangkan fragmen DNA target yang untuk seterusnya secara berulang menggandakan amplifikasi fragmen DNA target. Selanjutnya, kandidat primer perlu diuji untuk memastikan tingkat keakuratan dan reprodusibilitasnya. Lama waktu untuk disain primer dapat direduksi bila memanfaatkan data GenBank dan piranti lunak bioinformatika. Khusus untuk disain primer SNP yang berbasis bi-alel, situs SNP yang terdiri dari polimorfisme 2 basa pada satu titik, maka pada ujung 3’ primer forward, basa pertama ditentukan sebagai alel referensi alel pertama terdapat pada Primer Ref, dan basa kedua ditentukan sebagai alel alternatif alel kedua terdapat pada Primer Alt. Primer reverse berperan ganda dalam amplifikasi fragmen target, baik untuk berpasangan dengan Primer Ref maupun Primer Alt. Kemampuan primer SNAP yang berhasil didisain perlu dievaluasi untuk menghasilkan marka SNAP. Evaluasi efektivitas primer SNAP dilakukan menggunakan metode multiplex PCR untuk meningkatkan kecepatan dan efisiensi genotyping SNP. Multiplex PCR terdiri dari dua atau lebih pasang primer dalam satu campuran reaksi PCR untuk menghasilkan amplikon beberapa ukuran yang spesifik dari sekuens DNA yang berbeda Liu dan Wu 2012. Keunggulan metode multiplex PCR adalah beberapa marka secara simultan diamplifikasi dalam satu reaksi sekaligus. Metode ini dapat meningkatkan informasi yang diperoleh dari setiap pengujian, untuk mengurangi biaya, waktu dan tenaga Hayden et al. 2008. Protokol multiplex PCR telah secara luas digunakan untuk studi forensik, diagnosa penyakit, dan identifikasi patogen. Pada tanaman untuk identifikasi genotipe, penentuan populasi genetik, uji kemurnian benih, analisis keterpautan, analisis parental beberapa tanaman seperti buncis Masi et al. 2003, aprikot, cherry, barley, gandum Hayden et al. 2008, padi dan kedelai Chaerani et al. 2009, tanaman obat Schisandra chinensis Kim et al. 2012, anggur Migliaro et al. 2012, jagung Wen dan Zang 2012, rumput-rumputan Liu dan Wu 2012, tanaman obat Noccaea caerulescens Mousset et al. 2015. Situs SNP fragmen WRKY yang berasal dari tanaman kelapa belum pernah dievaluasi dan digunakan dalam studi keragaman genetik. Pengembangan marka SNAP berbasis gen ini diharapkan dapat mempermudah dan mempercepat seleksi genotipe kelapa yang memiliki karakter unggul. Tujuan penelitian ini ialah 1 mendisain pasangan primer untuk menghasilkan marka SNAP pada situs-situs SNP yang teridentifikasi; 2 mengembangkan metode multiplex PCR; dan 3 memvalidasi efektivitas pasangan primer tersebut dengan metode multiplex PCR.

3.2 Bahan dan Metode

Kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan September 2013 sampai Juni 2014 di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

3.2.1 Bahan Tanaman

Kelapa kopyor yang digunakan berasal dari daerah Jember, Lampung dan Pati.

3.2.2 Disain primer SNAP

Disain primer gen WRKY dilakukan dengan mengakses data sekuens dari bank data seperti yang tersaji pada Tabel 1. Sebanyak 35 sekuens gen WRKY WRKY2, WRKY6, WRKY7, WRKY19, WRKY21 dengan ukuran fragmen sekitar 236 –972 pb yang digunakan untuk mendisain primer SNAP. Sekuens terpilih adalah sekuens dengan tingkat similaritas yang tinggi dalam satu kelompok gen. Setiap sekuens dalam kelompok gen disusun dalam file teks menurut format Fasta. Sekuens disejajarkan menggunakan multiple alignment untuk mengidentifikasi letak satu basa nukleotida yang berbeda. Hasil multiple alignment gen WRKY disubmit secara online pada situs http:ausubellab.mgh.harvard.edu . Setiap submit hanya mendefinisikan satu titik SNP, sehingga untuk titik SNP lain maka submit dilakukan berulang. Masing- masing hasil desain untuk setiap situs SNP dipilih dua set empat primer yang terdiri atas satu set sepasang primer untuk alel referensi R dan satu set untuk alel alternatif A. Setelah diperoleh runutan primer dilanjutkan dengan pemilihan primer sesuai dengan jumlah situs SNP.

3.2.3 Reaksi Singleplex PCR

Primer SNAP diuji kemampuannya untuk menghasilkan produk amplifikasi menggunakan cetakan DNA genom kelapa kopyor. Dalam penelitian ini, pengujian efektivitas primer SNAP dilakukan menggunakan kelapa kopyor Pati dengan reaksi singleplex PCR. Suhu annealing primer SNAP dioptimasi menggunakan gradien thermocycling PCR untuk meningkatkan efisiensi PCR. Kombinasi suhu yang digunakan adalah 48.0 °C , 49.5 °C , 52.8 °C , 54.6 °C , 56.4 °C , 58.2 °C dan 60.0 °C . Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan KAPA2G TM PCR kit Kapa Biosystems Inc., USA. Komposisi reaksi singleplex terdiri atas 6.0 µL 5x buffer PCR, 0.6 µL MgCl 2 25 mM, 0.6 µL dNTPs 10 mM, masing-masing 0.75 µL untuk primer forward dan primer reverse dengan konsentrasi 10 µM, 0.1 µL Taq DNA Polymerase 5 U µL -1 dan ultra purewater ddH 2 O steril ditambahkan sehingga volume akhir menjadi 25 µL. Amplifikasi DNA menggunakan mesin PCR BioRad T100 TM Thermal Cycler. Amplifikasi DNA diawali dengan satu siklus tahap pre - denaturasi 95°C selama 3 menit, diikuti dengan 35 siklus yang terdiri atas: tahapan denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 49.5°C – 56.4°C selama 15 detik sesuai suhu anneal primer pada Tabel 3.3 , pemanjangan primer pada suhu 72°C selama 1 detik. Pada tahap akhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72°C selama 10 menit. P roduk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel agarosa 1 Vivantis Inc., USA dalam 1x SB buffer pada arus konstan sebesar 80 volt selama 30 menit. Ukuran produk amplifikasi diestimasi dengan perbandingan DNA ladder 100 pb Vivantis Inc., USA. Pita DNA divisualisasi menggunakan pewarnaan 33 vv Gelred TM Biotium Inc. di bawah lampu UV Vilber Lourmat Super Bright TFX-20 MX, Sigma-Aldrich dan didokumentasikan dengan kamera digital Nikon ® Coolpix L120, USA.

3.2.4 Optimasi, Validasi dan Aplikasi Teknik Multiplex PCR

Reaksi singleplex PCR menggunakan satu template DNA dengan satu pasang primer SNAP dalam satu reaksi sedangkan reaksi multiplex PCR menggunakan 2 –3 pasang primer SNAP dalam satu reaksi. Suhu annealing setiap primer SNAP dioptimasi menggunakan gradien thermocycling PCR untuk meningkatkan efisiensi PCR. Kombinasi suhu yang digunakan adalah 48.0°C, 48.8°C, 50.3°C, 52.6°C, 55.4°C, 57.6°C dan 59.1°C. Optimasi volume primer dilakukan dengan dua volume yaitu 0.375 µL [10 µM] dan 0.75 µL [10 µM]. Amplifikasi DNA menggunakan KAPA2G TM PCR kit Kapa Biosystems Inc., USA. Reaksi multiplex terdiri atas 6.0 µL 5x buffer PCR, 0.6 µL MgCl 2 25 mM, 0.6 µL dNTPs 10 mM, 0.375 µL untuk primer forward dan 0.375 µL untuk primer reverse dengan konsentrasi 10 µM, 0.2 µL Taq DNA Polymerase 5 unitµL, DNA template 3 µL [10 ngµL] dan ultra purewater ddH 2 O steril ditambahkan sehingga volume akhir menjadi 25 µL. Amplifikasi DNA menggunakan mesin PCR BioRad T100 TM Thermal Cycler. Amplifikasi DNA diawali dengan satu siklus tahap pre-denaturasi 95°C selama 3 menit, diikuti dengan 35 siklus yang terdiri atas: tahapan denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 48.8°C –55.4°C selama 15 detik sesuai suhu anneal primer pada Tabel 3.3, pemanjangan primer pada suhu 72°C selama 1 detik. Pada tahap akhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72°C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel agarosa 1 Vivantis Inc., USA dalam 1x Sodium Borate electrophoresis buffer SB buffer. Ukuran produk amplifikasi diestimasi dengan perbandingan DNA ladder 100 pb Vivantis Inc., USA pada arus konstan sebesar 80 volt selama 30 menit. Pita DNA divisualisasi menggunakan pewarnaan 33 vv Gelred TM Biotium Inc. di bawah lampu UV Vilber Lourmat Super Bright TFX-20 MX, Sigma-Aldrich dan didokumentasi- kan. Tahapan pekerjaan yang lain dilakukan berdasarkan penjelasan yang ada pada tahapan singleplex kecuali penggunaan volume pasangan primer 0.375 µL untuk validasi multiplex PCR dan aplikasi teknik duplex PCR untuk kelapa Kopyor Pati dan Jember.