4 KERAGAMAN GENETIK KELAPA Cocos nucifera L. INDONESIA BERDASARKAN MARKA SNAP BERBASIS
GEN WRKY, SUS, SACPD DAN ABI3
Abstrak
Pemanfaatan plasma nutfah kelapa di Balai Penelitian Tanaman Palma Manado untuk peningkatan produktivitas dan karakter unggul masih mengalami
kendala disebabkan oleh terbatasnya informasi genetik untuk banyak aksesi kelapa. Untuk meningkatkan informasi genetik tersebut dilakukan analisis
keragaman genetik menggunakan marka SNAP berbasis gen WRKY, SUS, SACPD dan ABI3. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi keragaman genetik
dan struktur genetik plasma nutfah 28 aksesi kelapa Dalam dan 13 aksesi kelapa Genjah berdasarkan 16 marka SNAP. Rata-rata nilai jumlah alel yang teramati
secara aktual Na, heterozigositas Ho dan He dan Polymorphic Information Content PIC berturut-turut adalah 2, 0.33, 0.39 dan 0.31. Hasil analisis
polimorfisme menunjukkan bahwa tiga belas lokus yang digunakan cukup informatif. Aksesi kelapa Dalam dan Genjah dapat dipisahkan ke dalam tiga
kelompok yang berbeda dengan piranti lunak DARwin menggunakan metode Neighbour Joining. Struktur genetik populasi dengan piranti lunak STRUCTURE
dapat membagi kelapa Dalam dan Genjah atas dua subgrup populasi, dari perhitungan ad hoc
maksimum ΔK diperoleh pada K=2. Kata kunci: kelapa Dalam, kelapa Genjah, single nucleotide amplified
polymorphism
Abstract
Utilization of coconut germplasm of the Indonesian Palm Research Institute in Manado to increase productivity and superior characters are still constraints
caused by the limited genetic information for many accessions. To increase genetic information genetic diversity analysis was done using the SNAP gene-
based markers WRKY, SUS, SACPD and ABI3. The purpose of the research was to evaluate the genetic structure and genetic diversity of the germplasm of the 28
Tall coconut accessions and 13 Dwarf coconut accession based on 16 SNAP markers. Average number of alleles Na, observed heterozygosity, expected
heterozygosity and the Polymorphic Information Content PIC are 2, 0.39 0.31 and 0.33, respectively. Polymorphism analysis of the results indicates that thirteen
loci used quite informative. Accession of Tall and Dwarf coconut can be separated into three distinct groups with DARwin software utilizing the Neighbour Joining
method. In line with this, the genetic structure of a population with the software STRUCTURE can also divide all coconut accessions in two population groups,
derived from ad hoc calculation maximum K obtained at K=2. Keywords: Tall coconut, Dwarf coconut, single nucleotide amplified
polymorphism
4.1 Pendahuluan
Plasma nutfah kelapa di Balai Penelitian Tanaman Palma Manado perlu mendapat perhatian, tidak hanya dalam bentuk mengumpulkan dan memelihara,
tetapi juga mengkarakterisasi keragaman genetik, mengevaluasi sifat-sifat yang dikehendaki dan memanfaatkannya untuk pemuliaan tanaman.
Untuk menunjang program peremajaan tanaman kelapa, diperlukan strategi penyediaan benih unggul. Tanaman kelapa sebagai tanaman tahunan mem-
butuhkan waktu yang lama untuk seleksi dan evaluasi hasil persilangan sehingga pendekatan bioteknologi melalui pengembangan marka molekuler diperlukan
untuk membantu mempercepat program pemuliaan.
Marka molekuler menghubungkan ciri genotipe dan fenotipe. Marka ini dapat digunakan untuk menentukan keragaman genetik inter dan intra spesies dan
menghasilkan peta genetik. Karakterisasi molekuler tanaman kelapa sudah
dilaporkan menggunakan marka RAPD Upadhyay et al. 2004, RFLP Lebrun et al. 1998, AFLP Perera et al. 1998, ISSR Manimekalai dan Nagarajan 2006,
SSR Rivera 1999; Perera et al. 2000; Teulat et al. 2000; Meerow et al. 2003; Rajesh et al. 2008; Devakumar et al. 2010; Xiao et al. 2013, dan SNP Herrera et
al. 2007.
Saat ini, marka SNP menjadi marka pilihan untuk studi genetik karena marka ko-dominan, bersifat bi-alel, terdapat di daerah coding dan non coding
region. Adanya SNP akan berpengaruh pada penentuan genetik suatu karakter yang memiliki nilai ekonomi, yang dapat digunakan dalam aplikasi marker
assisted selection dan seleksi genomik Tang et al. 2013.
Frekuensi SNP dalam genom sangat bervariasi tergantung jenis tanaman. Pada tanaman jagung ditemukan 1 SNP per 31 pb di bagian non-coding region
dan 1 SNP per 124 pb di bagian coding region Ching et al. 2002 . Pada
kedelai ditemukan 1.64 SNP per 1 kb coding region
dan 4.85 SNP per 1 kb non-coding region Zhu et al.
2001. Kanazin et al. 2002 melaporkan keberadaan 1 SNP setiap 189 pb pada tanaman barley.
Polimorfisme satu nukleotida ditemukan
sangat banyak, sehingga berpotensi sebagai marka yang tersebar di semua
bagian genom tanaman. Marka molekuler berbasis
SNP telah digunakan untuk studi genotipe Till et al.
2010, pembuatan peta tautan genetik beresolusi tinggi Drenkard et al. 2000, identifikasi
varietas Sun et al. 2011, dan seleksi untuk karakter
tertentu dalam proses pemuliaan tanaman Gupta et al. 2001. Keberadaan SNP juga berpotensi ditemukan pada sekuen DNA dari fragmen
WRKY, SUS, SACPD dan ABI3. Faktor transkripsi WRKY merupakan
superfamili protein yang mengandung satu atau dua daerah WRKY yang terkonservasi conserve region di antara anggota familinya. Famili gen WRKY
meningkat selama evolusi melalui duplikasi. Famili faktor transkripsi WRKY termasuk dalam sejumlah fungsi biologi pada tanaman yang pertama kali
dijelaskan oleh Eulgem et al. 2000. Faktor transkripsi ini memiliki sekuen asam amino yang tetap ada, daerah WRKYGQK merupakan asal penamaannya.
Beberapa gen WRKY telah diidentifikasi sebagai komponen penting dalam kontrol genetik mekanisme respon pertahanan pada sejumlah spesies tanaman Yu
et al. 2001; Ulker dan Somssich 2004; Ryu et al. 2006
. Gen WRKY diinduksi pada respon cekaman abiotik yaitu cekaman dingin atau kekeringan Rizhsky et al.
2002, berperan dalam senesen Robatzek dan Somssich 2001, berfungsi dalam
perkembangan trikoma dan seed coat Johnson et al. 2002, dan pengaturan ukuran biji Luo et al. 2005.
Enzim yang berperan utama dalam pembentukan sukrosa untuk kebutuhan energi, metabolik, dan organ penyimpan dalam sel tanaman adalah sucrose
synthase. Sucrose synthase menunjukkan aktivitas yang meningkat selama tahap akhir perkembangan endosperma buah kopi dan berjalan secara paralel dengan
akumulasi sukrosa Geromel et al. 2006. Pada beberapa studi, sintesis sukrosa dilakukan bersamaan dengan degradasi galaktomanan menjadi manosa dan
galaktosa.
Enzim lainnya yang berperanan penting dalam endosperma kelapa adalah stearoyl-acyl carrier protein desaturase SACPD, yaitu enzim yang terlibat pada
sintesis asam lemak. SACPD mengubah senyawa asam stearat asam lemak jenuh menjadi asam oleat asam lemak tak jenuh dengan membuat ikatan rangkap-cis
pada karbon ke-9 di senyawa asam stearat Kachroo et al. 2008. Mobilisasi galaktomanan pada proses perkecambahan embrio ternyata di bawah kontrol yang
berbeda antar tanaman, terutama peranan hormon seperti giberelin GA dan asam absisik ABA. Pada tanaman legum dan non-legum, ABA mempunyai peranan
sebagai modulator interaksi secara biokimia dan fisiologi antar endosperma dengan embrio pada proses perkecambahan dan awal pertumbuhan kecambah
Buckeridge et al. 2000; Potomati dan Buckeridge 2002.
Situs SNP fragmen WRKY, SUS, SACPD dan ABI3 yang berasal dari tanaman kelapa belum pernah dievaluasi dan digunakan dalam studi keragaman
genetik. Tujuan penelitian ini ialah 1 menghasilkan marka SNAP untuk analisis keragaman genetik kelapa Indonesia; dan 2 mendapatkan metode multiplex PCR
untuk analisis keragaman genetik kelapa Indonesia dengan gen WRKY.
4.2 Bahan dan Metode
Kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan September 2013 sampai Juni 2014 di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
4.2.1 Bahan Tanaman
Daun kelapa berasal dari kebun koleksi plasma nutfah Balai Penelitian Tanaman Palma Manado. Sebanyak 28 aksesi kelapa Dalam masing-masing 15
individu, 13 aksesi kelapa Genjah masing-masing 10 individu. Ke-41 aksesi ini selanjutnya digunakan nomor danatau singkatan aksesi adalah 1 Dalam
Aertembaga DAG, 2 Dalam Australia DAI, 3 Dalam Banyuwangi DBG, 4 Dalam Bali DBI, 5 Dalam Ilo Ilo DIO, 6 Dalam Jepara DJA, 7 Dalam
Kosinggolan DKL, 8 Dalam Kinabuhutan DKN, 9 Dalam Kalasey DKY, 10 Dalam Lansio DLO, 11 Dalam Lubuk Pakam DLP, 12 Dalam Mamuaya
DMA, 13 Dalam Mapanget DMT, 14 Dalam Marinsow DMW, 15 Dalam Pandu DPA, 16 Dalam Pungkol DPL, 17 Dalam Paslaten DPN, 18 Dalam
Palu DPU, 19 Dalam Rarumis DRS, 20 Dalam Sawarna DSA, 21 Dalam Sea DSE, 22 Dalam Seilon DSN, 23 Dalam Tenga DTA, 24 Dalam Takome
DTE, 25 Dalam Talise DTS, 26 Dalam Tontalete DTT, 27 Dalam Tebu DTU, 28 Dalam Wusa DWA, 29 Genjah Aromatik GAK, 30 Genjah Hijau
Jombang GHJ, 31 Genjah Hijau Nias GHN, 32 Genjah Kuning Bali GKB, 33
Genjah Kuning Malaysia GKM, 34 Genjah Kuning Nias GKN, 35 Genjah Merah Malaysia GMM, 36 Genjah Orange Sagerat GOS, 37 Genjah Raja
GRA, 38 Genjah Salak GSK, 39 Genjah Mansinam GMN, 40 Genjah Tebing Tinggi GTT dan 41 Genjah Waingapu GWU.
4.2.2 Amplifikasi DNA
Sebanyak 16 pasangan primer SNAP digunakan dalam penelitian ini. Delapan primer SNAP gen WRKY; empat primer SNAP gen SUS CNSUS1,
tiga primer SNAP gen SACPD CocoSACPD, dan satu primer SNAP gen ABI3 disajikan dalam Tabel 4.1. Enambelas pasangan primer tersebut dianggap sebagai
16 lokus marka SNAP. Primer-primer dari ketiga gen yang disebutkan terakhir diperoleh dari disain primer tidak disajikan dalam bab ini sesuai dengan disain
primer dengan gen WRKY yang telah diulas dalam Bab 3. Reaksi singleplex PCR untuk gen SUS, SACPD dan ABI3 dilakukan dengan menggunakan
KAPA2G
TM
PCR kit Kapa Biosystems Inc.,USA. Komposisi reaksi untuk amplifikasi DNA terdiri atas: 6.25 µL PCR mix, masing-masing 0.75 µL untuk
primer forward dan primer reverse dengan konsentrasi 10 µM, dan ditambah dengan ultra purewater ddH
2
O steril hingga mencapai volume akhir total 25 µL. Reaksi multiplex PCR untuk gen WRKY menggunakan satu template DNA
dengan 2 pasangan primer SNAP dalam satu reaksi. Komposisi reaksi multiplex terdiri atas 6.0 µL 5x buffer PCR, 0.6 µL MgCl
2
25 mM, 0.6 µL dNTPs 10 mM, 0.55 µL untuk primer forward dan 0.55 untuk primer reverse dengan konsentrasi
10 µM, 0.1 µL Taq DNA Polymerase 5 unitµL, DNA template 3 µL [10 ngµL] dan
ultra purewater ddH
2
O steril ditambahkan sehingga volume akhir menjadi 25
µL. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR BioRad
T100
TM
Thermal Cycler. Tahapan amplifikasi terdiri atas: satu siklus pre- denaturasi pada suhu 95°C selama 3 menit; diikuti dengan 35 siklus yang terdiri
atas tahapan denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 48.8
–55.4°C sesuai suhu penempelan primer pada Tabel 4.1 selama 15
detik, pemanjangan primer pada suhu 72°C selama 1 detik; dan diakhiri dengan satu siklus pemanjangan akhir pada suhu 72°C selama 10 menit. P
roduk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel agarosa 1 Vivantis Inc.,
USA dalam 1x SB buffer. Ukuran produk amplifikasi diestimasi dengan perbandingan ladder 100 pb Vivantis Inc., USA pada
arus konstan sebesar 80
volt selama 30 menit. Pita DNA divisualisasi menggunakan pewarnaan 33 vv Gelred
TM
Biotium Inc. di bawah lampu UV Vilber Lourmat Super Bright TFX- 20 MX, Sigma-Aldrich dan didokumentasikan Canon.
Tabel 4.1 Daftar primer SNAP gen WRKY, SUS, SACPD, ABI3 yang digunakan pada penelitian
No Nama primer Sekuens oligonukleotida
Panjang primer
basa
TM °C
Ukuran alel pb
1 WRKY21Ref
TCAAAAGTCGTACGTGAACCACGGG 25
66.7 319 WRKY21Rev
GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG 21
67.0 WRKY21Alt
CATCAAAAGTCGTACGTGAACCAGGGA 27 66.7 321
2 WRKY22Ref
TGATGATGGTTACCGCTGGGGG 22
66.7 260 WRKY22Rev
GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG 21
67.0 WRKY22Alt
TGATGATGGTTACCGCTGGGGC 22
66.8 260 3
WRKY61Ref AAAATATAATTCAGGGAATTAAGCAG
26 54.9 107
WRKY61Rev AAAGTAGTGAAAGGGAATCCAAA
23 55.1
WRKY61Alt AAAATATAATTCAGGGAATTAAGCAA
26 55.2 107
4 WRKY63Ref
ATAAATATCACATATCCCTGAGCAA 25
55.0 352 WRKY63Rev
CTACAGGTATTGTTAAATGTGCCA 24
55.0 WRKY63Alt
TATAAATATCACATATCCCTGAGCAG 26
54.9 353 5
WRKY71Ref CATCCGATCATTCGTGCG
18 58.1 354
WRKY71Rev ATCGATATCACTTGTGGTCTGAA
23 55.0
WRKY71Alt CATCCGATCATTCGTGCC
18 56.9 354
6 WRKY191Ref
CGTCTTCTGCAAACTAAGCTCA 22
56.3 211 WRKY191Rev
ATGATATATATACAAGACTACGCCGAT 27
55.0 WRKY191Alt
GTCTTCTGCAAACTAAGCTCG 21
53.5 210 7
WRKY211Ref ATTGCCTATTAAAAATAACAATTTACG
27 55.0 272
WRKY211Rev TACCATATATTAATGCGGATGAGAT
25 55.0
WRKY211Alt ATTGCCTATTAAAAATAACAATTTACC
27 54.2 272
8 WRKY213Ref
AGCATCTTGATCAATTACGATACC 24
55.4 237 WRKY213Rev
AAGCATCTTGATCAATTACGATACA 25
55.1 WRKY213Alt
TACCATATATTAATGCGGATGAGAT 22
54.2 238
9 CNSUS13 Ref
GAATGAGATGCTACAAAGAATAAATAAG 28 56
410 CNSUS13 Rev
TCTGTTCTAAATGGAACGCG 20
56 CNSUS13 Alt
GAATGAGATGCTACAAAGAATAAATAAA 28 56
10 CNSUS111 Ref ATCCTCCGCGTTCCATCTAG
20 60
400 CNSUS111 Rev
GGTTTCCATCACTGTAGTTAC C 22
60 CNSUS111 Alt
ATCCTCCGCGTTCCATCTAA 23
60 11 CNSUS114 Ref
GCTGAAAGTCACTGAAAAGGTAG 25
55 390
CNSUS114 Rev AAATTATTAAGAATGTCATGGTTTC
25 55
CNSUS114 Alt GCTGAAAGTCACTGAAAAGGTAC
23 55
12 CNSUS117 Ref CTGCAGTTCTCCTGTTAGTACG
23 61
385 CNSUS117 Rev
CAGATTGCTACCTGATGCAG 20
61 CNSUS117 Alt
CCTGCAGTTCTCCTGTTAGTACA 23
61 13 ABI33 Ref
GGAGGACATAGGCACCTCCTA 21
61 360
ABI31 Rev ACCAGATGATTATTTGCTCTCCT
23 61.4
ABI33 Alt GAGGACATAGGCACCTCCTG
20 61
14 CocoSACPD1Ref AAATATCATGACTTCAAGCATTCC 24
56 427
CocoSACPD1Rev TTGCCCCACATGCTGGTA 18
56 CocoSACPD1Alt
ATAAAATATCATGACTTCAAGCATTCT 27
56 15 CocoSACPD2Ref GGCTGTTCTCTGTCCTTGGA
20 55
442 CocoSACPD2Rev CGTTATCAAATTCATATATAGTAAAGGA 28
55 CocoSACPD2Alt
GCTGTTCTCTGTCCTTGGG 19
55 16 CocoSACPD3Ref AAGGTACGGGCTGTGCTC
18 54
425 CocoSACPD3Rev GGAGCATTATGCTTCCCTG
19 54
CocoSACPD3Alt AAGGTACGGGCTGTGCTT
18 54
Keterangan: Ref = Reference; Rev = Reverse; Alt = Alternate
