satu sampai empat nukleotida dari situs SNP Sutanto et al. 2013. Posisi mismatch adalah satu nukleotida yang berbeda selain pada situs SNP dari primer
forward terhadap sekuen aslinya. Posisi mismatch dari ujung 3’ sangat
berpengaruh terhadap keberhasilan amplifikasi DNA Bru et al. 2008. Semakin dekat mismatch
dengan ujung 3’ semakin besar kegagalan mendapatkan produk PCR. Berdasarkan hal tersebut, primer SNAP yang dipilih adalah primer dengan
posisi mismatch paling jauh dari ujung 3’.
Setiap situs SNP diperlukan dua pasangan primer, pasangan pertama primer forward dan reverse untuk alel referensi sedangkan pasangan kedua primer
forward dan reverse untuk alel alternatif. Dengan demikian, dari delapan situs SNP dihasilkan 16 pasang primer SNAP terpilih seperti yang ditampilkan pada
Tabel 3.3.
Tabel 3.3 Daftar primer SNAP yang didisain berdasarkan gen WRKY
No Id primer
Sekuens primer Panjang
primer Tm
°C Ukuran
pb 1
WRKY21Ref TCAAAAGTCGTACGTGAACCACGGG
25 50.3 319
WRKY21Rev GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG
21 50.3
WRKY21Alt CATCAAAAGTCGTACGTGAACCAGGGA 27
50.3 321 2
WRKY22Ref TGATGATGGTTACCGCTGGGGG
22 55.4 260
WRKY22Rev GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG
21 55.4
WRKY22Alt TGATGATGGTTACCGCTGGGGC
22 55.4 260
3 WRKY61Ref
AAAATATAATTCAGGGAATTAAGCAG 26 48.8 107
WRKY61Rev AAAGTAGTGAAAGGGAATCCAAA
23 48.8
WRKY61Alt AAAATATAATTCAGGGAATTAAGCAA 26
48.8 107 4
WRKY63Ref ATAAATATCACATATCCCTGAGCAA
25 50.3 352
WRKY63Rev CTACAGGTATTGTTAAATGTGCCA
24 50.3
WRKY63Alt TATAAATATCACATATCCCTGAGCAG
26 50.3 353
5 WRKY71Ref
CATCCGATCATTCGTGCG 18
50.3 354 WRKY71Rev
ATCGATATCACTTGTGGTCTGAA 23
50.3 WRKY71Alt
CATCCGATCATTCGTGCC 18
50.3 354 6
WRKY191Ref CGTCTTCTGCAAACTAAGCTCA
22 52.6 211
WRKY191Rev ATGATATATATACAAGACTACGCCGAT 27
52.6 WRKY191Alt
GTCTTCTGCAAACTAAGCTCG 21
52.6 210 7
WRKY211Ref ATTGCCTATTAAAAATAACAATTTACG 27
52.6 272 WRKY211Rev
TACCATATATTAATGCGGATGAGAT 25
52.6 WRKY211Alt
ATTGCCTATTAAAAATAACAATTTACC 27 52.6 272
8 WRKY213Ref
AGCATCTTGATCAATTACGATACC 24
55.4 237 WRKY213Rev
TACCATATATTAATGCGGATGAGAT 25
55.4 WRKY213Alt
AAGCATCTTGATCAATTACGATACA 22
55.4 238
Keterangan: Ref = Reference; Rev = Reverse; Alt = Alternate
3.3.2 Validasi SNAP Menggunakan Reaksi Singleplex PCR
Kemampuan primer SNAP yang dikembangkan untuk menghasilkan marka SNAP perlu dievaluasi. Validasi primer SNAP dilakukan menggunakan DNA
kelapa kopyor Pati dengan reaksi singleplex PCR. Hasil amplifikasi DNA template dengan reaksi singleplex PCR menggunakan 16 pasang primer SNAP
disajikan pada Gambar 3.2. Semua primer dapat menghasilkan produk PCR yang jelas menggunakan reaksi singleplex PCR. Hasil amplifikasi ini menjadi acuan
untuk pemilihan kombinasi pasangan primer dalam reaksi multiplex PCR. Menurut Sheng et al. 2003 sangat penting melakukan singleplex PCR karena
hasilnya dapat menunjukkan pasangan primer yang memiliki fragmen spesifik atau tidak spesifik. Fragmen yang spesifik akan menjadi dasar penentuan untuk
kombinasi pasangan primer dalam reaksi multiplex PCR. Sebelum melakukan reaksi multiplex
, semua pasangan primer diuji menggunakan singleplex PCR untuk estimasi suhu annealing yang optimal dan memastikan amplifikasi fragmen
yang benar Sint et al. 2012
. Setiap lokus SNP akan mengamplifikasi DNA template dalam dua reaksi
PCR, karena SNP memiliki sifat bi-alel yaitu terdapat alel reference dan alel alternate. Penggunaan reaksi singleplex PCR untuk lokus SNP tidak efisien
karena membutuhkan dua reaksi PCR dalam satu lokus SNP sehingga perlu dilakukan multiplex PCR untuk mengurangi biaya, waktu dan tenaga.
Gambar 3.2 Reaksi singleplex PCR untuk validasi efektivitas primer SNAP pada kelapa Kopyor Genjah Pati. Reaksi PCR menggunakan pasangan primer:
1 WRKY61 2 WRKY191 3 WRKY213 4 WRKY22 5 WRKY211 6 WRKY21 7 WRKY63 dan 8 WRKY211 dan
WRKY191
3.3.3 Optimasi Multiplex PCR
Bila dibandingkan dengan reaksi singleplex PCR, yaitu kondisi di mana satu pasang primer dipakai setiap kali reaksi, sedangkan pada multiplex PCR
mengandung beberapa pasang primer, sehingga faktor-faktor eksternal perlu dipertimbangkan. Pada perancangan teknik multiplex, pasangan primer harus
diperiksa selama waktu desain untuk semua kombinasi yang berpotensi membentuk primer mengalami cross-dimer pengikatan antar primer yang
berbeda. Lebih lagi, suhu pelekatan perlu dilakukan penyeimbangan antar semua primer sehingga mendapatkan hasil dengan performa yang sama.
Suhu pelekatan dan konsentrasi primer merupakan aspek yang sangat berpengaruh dalam reaksi PCR, terutama dalam multiplex PCR. Untuk mendapat-
kan suhu pelekatan terbaik, dilakukan PCR dengan gradient suhu dari 48 sampai dengan 59.1°C. Paling minim, suhu pelekatan yang dipilih dalah 48.8
–55.4°C, sedangkan waktu pelekatan dipilih selama 15 detik.
Hasil optimasi suhu untuk primer SNAP WRKY21 319 pb, WRKY22 260 pb dan WRKY61 107 pb
dengan DNA kelapa kopyor Kalianda dapat dilihat pada
Gambar 3.3 . Primer
M 1R 1A 2R 2A 3R 3A 4R 4A 5R 5A 6R 6A 7R 7A 8R 8A
352354 pb 319
272 260
238 210
107
1000 pb 500
100
