4.2.3 Genotiping Marka SNAP
Single nucleotide polymorphism SNP dideteksi dengan primer spesifik alel yang digunakan untuk amplifikasi DNA melalui reaksi PCR. Primer spesifik alel
memiliki kemampuan padu-padan mismatches yang spesifik di ujung 3’ sekuens
DNA target sehingga kemampuan primer untuk mengamplifikasi satu alel terhadap alel lain menjadikan situs tersebut dinilai sebagai polimorfisme akibat
subtitusi satu basa. Pada
Gambar 4.1A , primer P1 adalah primer reference F1
dan primer reverse R1 akan menempel secara sempurna dengan alel spesifik a1, tetapi tidak menempel pada alel
non spesifik a2 pada ujung 3’ dari sekuen gen. Primer F1R1 mengamplifikasi satu basa a1 lebih efisien dibandingkan satu basa
yang lain a2 pada satu titik SNP. Hal ini terjadi karena proses penempelan primer pada alel non-
spesifik di ujung 3’ dari sekuen DNA target adalah perpanjangan dari DNA polimerase dengan efisiensi yang lebih rendah apabila
dibandingkan dengan proses penempelan alel spesifik Drenkard et al. 2000. Proses yang sama juga berlaku untuk primer P2. Primer P2 yaitu primer alternate
F2 dan reverse R2 membentuk padu-padan penempelan dengan a1 dan a2 dari sekuen DNA, dan sesuai untuk mengamplifikasi a2.
Fragmen DNA yang dihasilkan kemudian dinilai berdasarkan ada atau tidak ada pita pada dua reaksi PCR pada setiap pasang primer. Marka SNAP bersifat
heterozigot, jika kedua primer P1 dan P2 mengamplifikasi fragmen DNA. Marka SNAP bersifat homozigot, jika hanya salah satu primer yang
mengamplifikasi fragmen DNA. Jika kedua primer P1 dan P2 gagal mengamplifikasi fragmen DNA, maka marka SNAP tidak bersifat bi-alel
Gambar
4.1 B.
Gambar 4.1 Skema diagram genotyping marka SNAP A Arah amplifikasi primer, dan B skema foto elektroforesis dan skoring. Pola ini digunakan
untuk validasi marka putatif SNAP pada fragmen gen WRKY, SUS, SACPD dan ABI3 dari tanaman kelapa
4.2.4 Analisis Data
Pita DNA hasil amplifikasi diskor secara manual sehingga menghasilkan data pasangan alel untuk masing-masing individu yang dianalisis. Selanjutnya
data hasil skoring diubah menjadi data biner dengan kode 1 jika ada pita dan kode 0 jika tidak ada pita, dan dikompilasi untuk menentukan matriks jarak genetik dan
parameter keragaman genetik rata-rata jumlah alel yang diamati, rata-rata jumlah alel efektif yang diamati, heterozigositas, dan persentase lokus yang polimorfik
menggunakan piranti lunak GenAlEx Peakall dan Smouse 2012. Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan piranti lunak DARwin5 Perrier et al.
2003, sedangkan perhitungan PIC dilakukan dengan menggunakan piranti lunak PowerMarker Liu dan Muse 2005. Piranti lunak STRUCTURE V2.3.4
Pritchard et al. 2000 digunakan untuk menduga struktur populasi dari kelapa Dalam dan Genjah, yang menunjukkan kemiripan genotipe masing-masing
individu dalam sub-grup yang didapatkan. Selanjutnya
nilai rata-rata dan ragam diplot
dalam “likelihood per K” dihitung dengan menggunakan piranti lunak STRUCTURE HARVESTER v.0.6.94 Earl dan vonHoldt 2012 dan metode
Evanno Evanno et al. 2005.
4.3 Hasil dan Pembahasan 4.3.1 Profil Alel, Tingkat Heterozigositas dan Polimorfisme Marka SNAP
Penelitian keragaman genetik 41 aksesi kelapa, yang terdiri dari 28 aksesi kelapa Dalam dan 13 aksesi kelapa Genjah berhasil digambarkan menggunakan
enam belas primer SNAP. Satu contoh pola pita DNA profil alel dengan marka SNAP diperoleh menggunakan primer WRKY63 352 pb dan WRKY191 210
pb disajikan dalam Gambar 4.2.
Gambar 4.2 Profil alel marka SNAP yang dihasilkan dengan menggunakan pasangan primer WRKY63 352 pb dan WRKY191 211 pb masing-
masing untuk kelapa Genjah Orange Sagerat A dan Dalam Bali B. M: DNA marker 100 pb ladder
Hasil analisis menunjukkan bahwa jumlah alel yang diperoleh untuk semua primer hanya dua alel karena primer SNAP didisain bersifat bi-alel. Nilai
heterozigositas pengamatan Ho antara 0.00 –0.89 dengan nilai rataan 0.33. Nilai
heterozigositas harapan He berkisar antara 0.04 –0.50 dengan nilai rataan 0.39.
Nilai heterozigositas menunjukkan jumlah penyebaran gen atau alel yang diamati pada suatu populasi. Jika nilai Ho lebih besar dari nilai He ini menunjukkan
bahwa lokus tersebut memiliki tingkat heterozigositas yang tinggi. Sebaliknya, jika nilai He lebih besar dari nilai Ho maka lokus tersebut memiliki tingkat
heterozigositas yang rendah Govindaraj et al. 2015. Nilai Polymorphic Information Content PIC, merupakan pengukuran tingkat polimorfisme setiap
lokus marka. Pada penelitian ini nilai PIC bervariasi dari 0.17 WRKY211 sampai 0.37 WRKY21, WRKY61, SACPD3 dengan rataan 0.31 Tabel 4.2.
Menurut Mateescu et al. 2005 nilai PIC dibagi atas tiga kelompok yaitu PIC 0.6 dikategorikan sebagai sangat informatif, nilai PIC 0.30
–0.59 sebagai cukup
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
B
1000 pb 500
100 1000 pb
500 100
352 pb 211
352 pb 211
Kategori