DNA menggunakan mesin PCR BioRad T100
TM
Thermal Cycler. Amplifikasi
DNA diawali dengan satu siklus tahap pre -
denaturasi 95°C selama 3 menit, diikuti dengan 35 siklus yang terdiri atas: tahapan denaturasi pada suhu 95°C selama 15
detik, penempelan primer pada suhu 49.5°C –
56.4°C selama 15 detik sesuai suhu
anneal primer pada Tabel 3.3 , pemanjangan primer pada suhu 72°C selama 1
detik. Pada tahap akhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72°C selama 10 menit.
P roduk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel
agarosa 1 Vivantis Inc., USA dalam 1x SB buffer pada arus konstan sebesar
80 volt selama 30 menit. Ukuran produk amplifikasi diestimasi dengan perbandingan DNA ladder 100 pb Vivantis Inc., USA. Pita DNA divisualisasi
menggunakan pewarnaan 33 vv Gelred
TM
Biotium Inc. di bawah lampu UV Vilber
Lourmat Super
Bright TFX-20
MX, Sigma-Aldrich
dan didokumentasikan dengan kamera digital Nikon
®
Coolpix L120, USA.
3.2.4 Optimasi, Validasi dan Aplikasi Teknik Multiplex PCR
Reaksi singleplex PCR menggunakan satu template DNA dengan satu pasang primer SNAP dalam satu reaksi sedangkan reaksi multiplex PCR
menggunakan 2 –3 pasang primer SNAP dalam satu reaksi. Suhu annealing setiap
primer SNAP dioptimasi menggunakan gradien thermocycling PCR untuk meningkatkan efisiensi PCR. Kombinasi suhu yang digunakan adalah 48.0°C,
48.8°C, 50.3°C, 52.6°C, 55.4°C, 57.6°C dan 59.1°C. Optimasi volume primer dilakukan dengan dua volume yaitu 0.375 µL [10 µM] dan 0.75 µL [10 µM].
Amplifikasi DNA menggunakan KAPA2G
TM
PCR kit Kapa Biosystems Inc., USA.
Reaksi multiplex terdiri atas 6.0 µL 5x buffer PCR, 0.6 µL MgCl
2
25 mM, 0.6 µL dNTPs 10 mM, 0.375 µL untuk primer forward dan 0.375 µL untuk primer
reverse dengan konsentrasi 10 µM, 0.2 µL Taq DNA Polymerase 5 unitµL, DNA template 3 µL [10 ngµL] dan ultra purewater ddH
2
O steril ditambahkan sehingga volume akhir menjadi 25 µL. Amplifikasi DNA menggunakan mesin
PCR BioRad T100
TM
Thermal Cycler. Amplifikasi DNA diawali dengan satu
siklus tahap pre-denaturasi 95°C selama 3 menit, diikuti dengan 35 siklus yang terdiri atas: tahapan denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, penempelan
primer pada suhu 48.8°C –55.4°C selama 15 detik sesuai suhu anneal primer pada
Tabel 3.3, pemanjangan primer pada suhu 72°C selama 1 detik. Pada tahap akhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72°C selama 10 menit. Produk
PCR dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel agarosa 1 Vivantis Inc., USA dalam 1x Sodium Borate electrophoresis buffer SB buffer. Ukuran produk
amplifikasi diestimasi dengan perbandingan DNA ladder 100 pb Vivantis Inc., USA pada arus konstan sebesar 80 volt selama 30 menit. Pita DNA divisualisasi
menggunakan pewarnaan 33 vv Gelred
TM
Biotium Inc. di bawah lampu UV Vilber Lourmat Super Bright TFX-20 MX, Sigma-Aldrich dan didokumentasi-
kan. Tahapan pekerjaan yang lain dilakukan berdasarkan penjelasan yang ada pada tahapan singleplex kecuali penggunaan volume pasangan primer 0.375 µL
untuk validasi multiplex PCR dan aplikasi teknik duplex PCR untuk kelapa Kopyor Pati dan Jember.
3.3 Hasil dan Pembahasan 3.3.1 Disain Primer SNAP
3.3.1.1 Ketersediaan sekuen gen WRKY
Ketersediaan sekuens gen WRKY tanaman kelapa di GenBank NCBI digunakan untuk mendisain primer SNAP. Sebanyak 35 sekuens gen WRKY
WRKY2, WRKY6, WRKY7, WRKY19, WRKY21 dengan kisaran ukuran sekuens 236
–972 dipilih untuk dilakukan penjajaran sekuen Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Daftar fragmen gen WRKY dari kelapa Cocos nucifera yang terdapat di database GenBank dan jumlah single nucleotide polymorphism SNP
berdasarkan hasil multiple sequence analysis MSA
Gen Data Aksesi GenBank
Jumlah Jumlah
fragmen
Range ukuran
sekuens
ID aksesi SNP
a
WRKY2 8
236
–
959 FJ956959.1, FJ956960.1,
FJ956961.1, FJ956962.1, FJ956963.1, FJ956964.1,
DQ307150.1, DQ861409.1 2
WRKY6 7
724
–
927 FJ957104.1, FJ957105.1,
FJ957106.1, FJ957107.1, FJ957108.1, FJ957109.1,
DQ307153.1 2
WRKY7 6
607
–
639 FJ957178.1, FJ957179.1,
FJ957180.1, FJ957181.1, FJ957182.1, FJ957183.1
1 WRKY19
7 354
–
525 FJ957389.1, FJ957390.1,
FJ957391.1, FJ957392.1, FJ957393.1, FJ957394.1,
DQ307157.1 1
WRKY21 7
764
–
972 FJ957030.1, FJ957031.1,
FJ957032.1, FJ957033.1, FJ957034.1, FJ957035.1,
DQ307158.1 2
Total 35
- -
8
Keterangan:
a
Titik SNP diperoleh setelah dilakukan multiple sequence alignment.
3.3.1.2 Multiple sequence alignment dan identifikasi SNP
Setiap sekuens dalam kelompok gen WRKY disusun dalam file teks menurut format Fasta. Sekuens disejajarkan menggunakan multiple alignment
untuk mengidentifikasi letak satu basa nukleotida yang berbeda. Dua jenis basa nukleotida yang berbeda dipilih menurut prinsip bi-alel, yaitu pendugaan titik
SNP yang mungkin terjadi pada dua kromosom homolog dari genom individu diploid. Salah satu contoh titik SNP gen WRKY6 sebagai acuan
urutan sekuens
ditunjukkan pada Gambar 3.1. Rekapitulasi hasil multiple alignment lima gen WRKY disajikan dalam Tabel 3.2, dilengkapi dengan posisi SNP, letak basa SNP
dan rasio alel SNP.
Gambar 3.1 Multiple sequence alignment dari gen WRKY6 pada kelapa menunjukkan adanya posisi Single Nucleotide Polymorphisms SNP
pada posisi ke-3 di ukuran basa 795 dari sekuens. Variasi nukleotida sebesar berturut-turut untuk T 57.1 atau C 42.9
Tabel 3.2 Daftar titik SNP berdasarkan multiple sequence alignment gen WRKY dari tanaman kelapa
Gen WRKY Letak SNP
a
Alternatif bi-alel SNP
b
Rasio alel SNP
c
WRKY2 1
2 697
721 AG
GC 68
78 WRKY6
1 3
156 795
CT TC
67 47
WRKY7 1
561 TA
56 WRKY19
1 74
GA 67
WRKY21 1
3 447
553 GC
AG 57
67
Keterangan:
a
X Y = mengindikasikan urutan titik SNP X dari gen WRKY yang terdapat pada
nomor basa tertentu setelah dilakukan MSA Y;
b
XY = mengindikasikan alel mayor X dan alel minor Y;
c
XY = mengindikasikan rasio alel mayor terhadap total jumlah SNP dari fragmen yang dievaluasi.
3.3.1.3 Disain primer SNAP berdasarkan SNP
Kriteria untuk mendisain primer SNAP, di sekitar situs SNP terdapat minimal 25 basa. Hal ini untuk memenuhi panjang oligonukleotida sebagai primer
yang sesuai untuk PCR, terutama pada situs SNP di ujung 5’ dan 3’ runutan
fragmen DNA. Kriteria yang sama juga menjadi syarat dalam mendisain primer dCAPS menggunakan perangkat lunak dCAPS Finder Shahinnia dan Sayed-
Tabatabaei 2009.
Disain primer SNAP menggunakan hasil multiple sequence alignment untuk fragmen gen WRKY diajukan secara online submit sekuensnya menggunakan
piranti lunak online http:ausubellab.mgh.harvard.edu. Setiap submit hanya mendefinisikan satu titik SNP, sehingga untuk titik SNP lain maka submit
dilakukan berulang. Disain primer dari satu titik SNP menggunakan piranti lunak WebSNAPER diperoleh beberapa alternatif pasangan primer untuk menghasilkan
marka SNAP. Pemilihan pasangan primer dilakukan dengan memperhatikan beberapa hal yaitu suhu Tm tidak jauh berbeda dan posisi mismatch berada pada
