2. Hasil Pewarnaan IHK Mekanisme aktivitas antitumor bubuk daun cincau hijau (Premna blongifolia Merr.) pada mencit c3h yang ditransplantasi sel tumor payudara
Sebagaimana Gambar 21 a, b, hal ini menunjukkan bahwa inti sel pada jaringan payudara mencit kelompok E belum banyak mengalami perubahan dan
variasi bentuk. Pada tingkat mitosis sel, hasil pewarnaan HE jaringan tumor menunjukkan bahwa skor rata-rata tingkat mitosis sel tumor pada mencit E1 sama
dengan E2, yaitu 1,00+0,00. Skor yang sama tersebut mengasumsikan bahwa sel- sel tumor pada mencit E1 dan E2 memiliki tingkat pertumbuhan sel tumor yang
sama. Hal ini diduga dipengaruhi oleh faktor pakan yang mengandung dosis bubuk daun cincau hijau 2,64 sebagai dosis tertinggi.
Makin tinggi dosis bubuk daun cincau hijau pada pakan mencit, makin tinggi kemungkinan untuk dapat menjaga jaringan pada kelompok E agar tetap
terdiferensiasi dengan baik. Hal ini dimungkinkan karena bubuk daun cincau hijau mengandung sejumlah senyawa fitokimia yang berkorelasi dengan aktivitas
antioksidan dan antikanker, sebagaimana pernyataan Moongkarndi et al. 2004 dan Meiyanto et al. 2008.
Hasil pewarnaan HE dispesifikasi lanjut dengan hasil pewarnaan IHK. Pemberian skor pada jaringan hasil pewarnaan IHK dilakukan berdasarkan
kepekatan warna substrat DAB sebagai hasil reaksi dengan enzim HRP horseradish peroxidase yang telah terlabel pada antibodi sekunder. Reaksi
antara HRP dan DAB menghasilkan warna coklat Kiernan 1990.
4. 4. 2. Hasil Pewarnaan IHK
Pewarnaan IHK yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan dua jenis antibodi primer, yaitu antibodi anti-CD31 dan antibodi antikaspase-3. CD31
sebagai penanda vaskularisasi dan kaspase-3 sebagai penanda apoptosis. Pada penanda vaskularisasi, keberadaan DAB menunjukkan terjadinya
vaskularisasi pada jaringan tumor. Berdasarkan Tabel 8, pada penanda vaskularisasi, maka dapat diketahui bahwa sebagian besar keberadaan DAB
bersifat tidak terlokalisasi. Warna coklat DAB yang tidak terlokalisasi terdapat pada semua kelompok mencit. Skor rata-rata warna coklat DAB yang tertinggi
terdapat pada jaringan tumor mencit kelompok E, yaitu pada mencit E2, dengan skor 4,17+0,75. Skor rata-rata warna coklat DAB yang terendah terdapat pada
jaringan tumor mencit kelompok C, yaitu pada mencit C2, dengan skor 0,57+0,54. Selanjutnya, skor rata-rata warna coklat DAB yang terlokalisasi hanya terdapat
pada tiga ekor mencit, yaitu mencit C1, D1 dan D2. Skor tersebut berturut-turut adalah 2,00+1,29, 3,00+2,28 dan 5,50+6,33.
Chantrain et al. 2003 menyatakan bahwa kuantifikasi vaskularisasi pada sediaan histopatologi sangat memungkinkan untuk mendeteksi struktur
nonendotelial, sehingga menjadikan hasil pewarnaan IHK menjadi tidak terlokalisasi. Pada dasarnya, antibodi anti-CD31 merupakan antibodi yang
memiliki sensitivitas tinggi untuk mendeteksi keberadaan CD31. Pada kondisi tertentu, adakalanya antibodi tersebut mendeteksi sel plasma dan area nekrotik.
Hal ini menyebabkan warna coklat hasil reaksi DAB dengan HRP yang terlabel pada antibodi sekunder menjadi tidak spesifik dan intensitas warna coklatnya
rendah. Dengan demikian, skor penanda vaskularisasi tertinggi pada mencit kelompok E diduga karena adanya dosis bubuk daun cincau hijau tertinggi
2,64 pada pakan meningkatkan jumlah sel plasma serta terjadinya nekrosis pada jaringan tumor.
Pada penanda apoptosis, keberadaan DAB menunjukkan terjadinya apoptosis pada jaringan tumor. Berdasarkan Tabel 7, maka dapat diketahui bahwa
keberadaan DAB ditemukan pada sebagian besar jaringan tumor mencit dari semua kelompok, baik bersifat terlokalisasi maupun tidak terlokalisasi. Warna
coklat DAB yang tidak terlokalisasi terdapat pada semua kelompok mencit. Dalam hal ini, skor rata-rata warna coklat DAB yang tertinggi terdapat pada
jaringan tumor mencit E2, yaitu 3,38+0,92. Skor rata-rata warna coklat DAB yang terendah terdapat pada jaringan tumor mencit kelompok D D1 dan D2
yaitu 1,00+0,00. Selanjutnya, skor rata-rata warna coklat DAB yang terlokalisasi terdapat pada sebagian besar mencit dari semua kelompok. Skor rata-rata warna
coklat DAB yang tertinggi terdapat pada jaringan tumor mencit D2, yaitu 21,83+6,24. Skor rata-rata warna coklat DAB yang terendah terdapat pada dua
ekor mencit, yaitu mencit B2 0,38+1,26 dan E2 0,38+0,74. Terdapat satu ekor mencit yang pada lapang pandang keberadaan DAB pada jaringannya tidak
ditemukan DAB terlokalisasi, yaitu mencit B1 dengan skor 0,00+0,00. Berdasarkan skor rata-rata warna coklat DAB, dapat diketahui bahwa skor
mencit kelompok B lebih rendah dibandingkan kelompok perlakuan C, D dan E. Hal ini diduga sebagai pengaruh dosis bubuk daun cincau hijau 0 pada pakan
mencit kelompok B, sehingga tidak dapat mengaktivasi proses apoptosis dengan baik. Skor tertinggi yang terlokalisasi terdapat pada mencit kelompok D pakan
mengandung bubuk daun cincau hijau dosis 1,76. Hal ini dapat didukung oleh pernyataan Hadjiloucas et al. 2001, bahwa keberadaan kaspase-3 menunjukkan
awal terjadinya apoptosis. Hadjiloucas et al. 2001 juga menyatakan bahwa apoptosis akan lebih banyak terjadi pada jaringan tumor yang invasif.
Selanjutnya, warna coklat DAB yang tidak terlokalisasi disebabkan hanya sejumlah kecil sel kurang dari 0,01 yang mengalami apoptosis. Pada
dasarnya, sel tersebut menunjukkan perubahan morfologis yang disebabkan oleh apoptosis. Jumlah sel yang sedikit menyebabkannya tidak dapat terwarnai secara
kontras oleh DAB. Perbedaan skor IHK kaspase-3 pada mencit kelompok perlakuan C, D dan
E, diduga karena perbedaan dosis bubuk daun cincau hijau pada pakan. Pada kategori terlokalisasi, mencit kelompok D memiliki skor yang lebih tinggi
dibandingkan mencit kelompok C dan E. Pada kategori tidak terlokalisasi, mencit kelompok D memiliki skor yang lebih rendah dibandingkan mencit
kelompok C dan E, sedangkan skor mencit kelompok E lebih tinggi dibandingkan C. Hal ini berkorelasi dengan rata-rata berat dan volume tumor mencit kelompok
D yang nilainya terkecil dibandingkan mencit kelompok B, C dan E. Hal ini diduga karena dosis bubuk daun cincau hijau 1,76 pada pakan mencit kelompok
D berpotensi lebih baik dalam meningkatkan jumlah kaspase-3 untuk mengaktivasi terjadinya apoptosis dibandingkan dosis 0,88 dan 2,64.
Makin tinggi dosis bubuk daun cincau hijau pada pakan, maka makin tinggi kandungan senyawa fitokimia yang berperan sebagai antioksidan dan
antikanker. Pandoyo 2000 menyatakan bahwa sifat antikanker cincau hijau P. oblongifolia Merr. diduga karena mengandung alkaloid. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Hanani et al. 2005, bahwa alkaloid juga memiliki aktivitas antioksidan. Data uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol bubuk daun cincau
hijau menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan memiliki tingkat efektivitas, yaitu pada konsentrasi 200 µgml. Konsentrasi larutan ekstrak metanol bubuk daun
cincau hijau lebih dari 200 µgml menunjukkan penurunan aktivitas antioksidan.
Hal ini dapat mempengaruhi perbedaan efektivitas dosis 1,76 dan 2,64 pada pakan.
Berdasarkan skor IHK kaspase-3, dosis 1,76 memiliki efektivitas yang lebih baik dibandingkan dosis 0,88 dan 2,64 dalam meningkatkan jumlah
kaspase-3 untuk mengaktivasi terjadinya apoptosis. Salah satu jenis alkaloid adalah bisbenzylisoquinolines Oliveira et al. 2009, yang mana salah satu jenis
bisbenzylisoquinolines adalah tetrandrin, yang berfungsi sebagai senyawa antikanker dengan cara menginduksi terjadinya apoptosis Levine 2005. Hal ini
berkorelasi dengan rata-rata berat dan volume tumor mencit kelompok D yang nilainya terkecil dibandingkan mencit kelompok B, C dan E. Selanjutnya, Hua
dan Xu 2000 dan Dash 2005 menyatakan bahwa enzim kaspase-3 dapat mengaktivasi DNase yang akan berperan dalam fragmentasi DNA sebagai tahap
lanjut terjadinya apoptosis. Dengan demikian, dapat diketahui bahwa apoptosis berperan mengurangi rata-rata berat dan volume tumor mencit.
Jaringan tumor mencit kelompok B sebagai hasil pewarnaan IHK CD31 dan kaspase-3 disajikan pada Gambar 22.
a b
c d
Keterangan: tanda panah merah menunjukkan DAB yang terlokalisasi; lingkaran merah menunjukkan DAB
yang tidak terlokalisasi.
Gambar 22 Hasil IHK pada jaringan tumor mencit yang diberi pakan mengandung bubuk daun cincau hijau 0 dengan
ditransplantasi tumor a= CD31 jaringan tumor mencit B2 100 kali; b= CD31 jaringan tumor mencit B1 100 kali;
c= kaspase-3 jaringan tumor mencit B2 100 kali; d= kaspase-3 jaringan tumor mencit B1 100 kali
Jaringan tumor mencit kelompok C sebagai hasil pewarnaan IHK CD31 dan kaspase-3 disajikan pada Gambar 23.
a b
c d
Keterangan: tanda panah merah menunjukkan DAB yang terlokalisasi; lingkaran merah menunjukkan DAB
yang tidak terlokalisasi.
Gambar 23 Hasil IHK pada jaringan tumor mencit yang diberi pakan mengandung bubuk daun cincau hijau 0,88 dengan
ditransplantasi tumor a= CD31 jaringan tumor mencit C2 40 kali; b= CD31 jaringan tumor mencit C1 40 kali;
c= kaspase-3 jaringan tumor mencit C2 40 kali; d= kaspase- 3 jaringan tumor mencit C1 40 kali
a b
c d
Keterangan: tanda panah merah menunjukkan DAB yang terlokalisasi.
Gambar 24 Hasil IHK pada jaringan tumor mencit yang diberi pakan mengandung bubuk daun cincau hijau 1,76 dengan
ditransplantasi tumor a= CD31 jaringan tumor mencit D2 40 kali; b= CD31 jaringan tumor mencit D1 40 kali;
c= kaspase-3 jaringan tumor mencit D2 40 kali; d= kaspase-3 jaringan tumor mencit D1 40 kali
Jaringan tumor mencit kelompok E sebagai hasil pewarnaan IHK CD31 dan kaspase-3 disajikan pada Gambar 25.
a b
c d
Keterangan: tanda panah merah menunjukkan DAB yang terlokalisasi; lingkaran merah menunjukkan DAB
yang tidak terlokalisasi.
Gambar 25 Hasil IHK pada jaringan tumor mencit yang diberi pakan mengandung bubuk daun cincau hijau 2,64 dengan
ditransplantasi tumor a= CD31 jaringan tumor mencit E2 100 kali; b= CD31 jaringan tumor mencit E1 40 kali;
c= kaspase-3 jaringan tumor mencit E2 40 kali; d= kaspase-3 jaringan tumor mencit E1 40 kali