dapat disimpan pada kotak preparat Panigoro et al. 2007. Selanjutnya, sediaan histologis siap diamati di bawah mikroskop dan direkam dengan foto digital.
Perubahan histopatologi yang terlihat pada jaringan berdasarkan pewarnaan IHK dikelompokkan berdasarkan dua parameter, yaitu rata-rata jumlah
dot untuk warna coklat DAB yang terlokalisasi dan rata-rata tingkat kepekatan untuk DAB yang tidak terlokalisasi karena membentuk area berwarna coklat.
Warna coklat DAB yang terlokalisasi dihitung berdasarkan jumlah dot yang teramati pada tiap lapang pandang. Warna coklat DAB yang tidak terlokalisasi
dihitung berdasarkan analisis semikuantitatif. Hal ini dilakukan dengan memberikan skor terhadap tingkat kepekatan warna coklat pada area yang
terbentuk Kanter et al. 2004 yang dimodifikasi, Suja et al. 2009 yang dimodifikasi. Skor IHK pada penelitian ini meliputi 0 tidak terdapat area
berwarna coklat, 0, 1 warna coklat sangat kurang pekat, + 1-20, 2 warna coklat kurang pekat, + 21-40, 3 warna coklat agak pekat, + 41-60, 4 warna
coklat pekat, + 61-80, dan 5 warna coklat sangat pekat, + 81-100. Hal ini sebagaimana Kanter et al. 2004 yang memberi skor pewarnaan IHK secara
semikuantitatif dengan rincian skor 0 tidak ada warna, 1 lemah, 2 cukup kuat, 3 kuat, dan 4 sangat kuat. Suja et al. 2009 memberi skor pewarnaan IHK
dengan perkiraan persentase kepekatan warna coklat hasil reaksi enzim HRP dan DAB yang ditunjukkan dengan tanda positif +. Skor Suja et al. 2009 meliputi
0 tidak ada warna, 1-30 +, 30-60 ++, dan 60-100 +++.
3. 4. Analisis Data
Analisis data pada penelitian ini menggunakan analisis ragam dengan rancangan percobaan, serta analisis deskriptif. Rancangan percobaan digunakan
untuk mengetahui pengaruh perbedaan dosis bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr dan faktor transplantasi tumor terhadap pertumbuhan tumor
pada mencit C3H. Penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok RAK dengan model sebagai berikut Steel dan Torrie 1991:
Y
ijk
= μ + α
i
+ β
j
+ ε
ijk
Keterangan: Y
ijk
dan faktor transplantasi tumor level ke-j = respon pengamatan faktor dosis bubuk daun cincau hijau level ke-i
μ = rataan umum α
i
β = pengaruh faktor dosis bubuk daun cincau hijau level ke-i
j
ε = pengaruh faktor transplantasi tumor level ke-j
ijk
transplantasi tumor = pengaruh galat faktor dosis bubuk daun cincau hijau dan faktor
Hipotesis rancangan acak kelompok RAK terhadap data pertumbuhan tumor adalah sebagai berikut:
1 H
terhadap pertumbuhan tumor α
: faktor dosis bubuk daun cincau hijau tidak berpengaruh nyata
i
H = 0
1
berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan tumor α
: minimal ada satu faktor dosis bubuk ekstrak cincau hijau yang
i
≠ 0 2
H tumor
β : faktor transplantasi tumor tidak berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan
j
H = 0
1
terhadap pertumbuhan tumor β
: minimal ada satu faktor transplantasi tumor yang berpengaruh nyata
j
≠ 0 Jika hasil analisis ragam ANOVA berbeda nyata, maka dilanjutkan
dengan uji lanjut Duncan. Selanjutnya, analisis jaringan tumor berdasarkan pewarnaan HE dan IHK menggunakan analisis deskriptif.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4. 1. Uji Fitokimia berdasarkan metode Harborne 1984
Uji fitokimia merupakan pengujian kualitatif untuk mengetahui keberadaan senyawa-senyawa fitokimia. Uji fitokimia pada penelitian ini
dilakukan terhadap daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. segar Lampiran 11 dan bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. Lampiran 12. Hasil uji
fitokimia disajikan pada Tabel 6. Tabel 6 Hasil uji fitokimia
Nama senyawa Hasil uji fitokimia
Daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. segar
Bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr.
Alkaloid +
+ Steroid
- -
Saponin +
+ Fenol hidrokuinon
+ +
Molisch +
+ Benedict
+ +
Biuret +
- Ninhidrin
+ -
Flavonoid +
- Tanin
+ +
Keterangan: + = senyawa terdeteksi
- = senyawa tidak terdeteksi
Daun Cincau Hijau P. oblongifolia Merr. Segar
a Uji alkaloid
Uji alkaloid pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang positif. Hasil tersebut diindikasikan oleh adanya endapan pada ketiga larutan uji dengan
masing-masing jenis pereaksi yang berbeda. Pada larutan uji dengan pereaksi Mayer dihasilkan sedikit endapan berwarna putih. Pada larutan uji dengan
pereaksi Dragendorff dihasilkan sedikit endapan merah jingga. Pada larutan uji dengan pereaksi Wagner dihasilkan sedikit endapan berwarna coklat. Ketiga hasil
uji alkaloid tersebut sesuai dengan Harborne 1984. Intensitas dan jumlah endapan yang rendah pada hasil reaksi dengan masing-masing pereaksi dapat
disebabkan oleh sampel yang berupa daun segar. Hal ini karena sampel tersebut hanya dihaluskan dengan mortar dan tidak diberi perlakuan tertentu sebelum diuji,
sehingga senyawa alkaloid belum terekstrak dengan baik.
Keberadaan senyawa alkaloid pada daun cincau hijau segar menunjukkan bahwa daun cincau hijau memiliki potensi sebagai bahan antikanker. Hal sesuai
dengan pernyataan Kintzios dan Barberaki 2004 serta Meiyanto et al. 2008 bahwa alkaloid merupakan senyawa yang dapat berperan sebagai antikanker.
b Uji steroid
Uji steroid pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini diindikasikan oleh adanya pembentukan warna hijau muda transparan pada
larutan uji. Hasil uji steroid yang positif diindikasikan oleh adanya pembentukan warna hijau-biru Harborne 1984 pada larutan uji.
c Uji saponin
Uji saponin pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang positif. Hasil uji saponin menunjukkan adanya pembentukan busa yang stabil selama 30
menit pada permukaan larutan uji, dan jika ditambahkan satu tetes HCl 2 N busa tidak hilang Harborne 1984.
d Uji fenol hidrokuinon
Uji fenol hidrokuinon pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang positif. Hal ini karena uji fenol hidrokuinon menunjukkan adanya
pembentukan warna hijau muda setelah ditambahkan FeCl
3
pada larutan uji. Indikasi positif pada hasil uji fenol hidrokuinon ditunjukkan oleh adanya
pembentukan warna hijau atau hijau biru setelah ditambahkan FeCl
3
e Uji Molisch
pada larutan uji Harborne 1984. Intensitas warna hasil uji fenol hidrokuinon yang rendah
dapat disebabkan oleh sampel yang berupa daun segar. Hal ini karena sampel tersebut hanya dihaluskan dengan mortar dan tidak diberi perlakuan tertentu
sebelum diuji, sehingga senyawa fenol hidrokuinon belum terekstrak dengan baik.
Uji Molisch pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang positif. Hasil uji Molisch menunjukkan adanya pembentukan warna ungu di antara dua
lapisan cairan pada larutan uji. Warna ungu tersebut terbentuk di antara lapisan berwarna merah bata pada bagian atas dan lapisan transparan di bagian bawah
larutan uji Harborne 1984. Hasil uji Molisch berperan untuk mengidentifikasi keberadaan karbohidrat
pada bahan yang diuji Harborne 1984. Hasil uji Molisch pada daun cincau hijau
segar ini sesuai dengan hasil analisis proksimat karbohidrat by difference dan hasil analisis serat sebagaimana penelitian Chalid 2003 dan Jacobus 2003.
Serat merupakan salah satu jenis karbohidrat.
f Uji benedict
Uji benedict berperan untuk mengidentifikasi keberadaan gula pereduksi Harborne 1984. Uji benedict pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil
yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau. Harborne 1984 menyatakan bahwa indikasi positif pada hasil uji benedict
ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau, kuning atau endapan merah bata pada larutan uji.
g Uji biuret
Uji biuret berperan untuk mengidentifikasi keberadaan senyawa peptida Harborne 1984. Uji biuret pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil
yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna ungu Harborne 1984 pada larutan uji. Warna ungu terbentuk di bagian tengah larutan
yang didominasi warna hijau tosca. Warna ungu tersebut terbentuk setelah larutan uji dibiarkan selama beberapa saat. Hal ini memungkinkan terjadinya
reaksi kimia, yaitu bereaksinya pereaksi biuret dengan senyawa peptida, sehingga dapat terbentuk warna ungu pada larutan uji.
h Uji ninhidrin
Uji ninhidrin berperan untuk
mengidentifikasi keberadaan
asam amino Harborne 1984. Uji ninhidrin pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan
warna ungu Harborne 1984 pada larutan uji. Warna ungu tersebut terbentuk setelah larutan uji dibiarkan selama beberapa saat, yaitu setelah pemanasan. Hal
ini memungkinkan terjadinya reaksi kimia, yaitu bereaksinya asam amino dengan suhu pemanasan dan pereaksi ninhidrin, sehingga dapat terbentuk warna ungu
pada larutan uji. Proses pemanasan tersebut merupakan tahapan penting. Hal ini karena proses pemanasan dapat membantu terjadinya denaturasi protein
Lehninger 1982, sehingga protein pada daun cincau hijau segar dapat terurai dan susunan asam aminonya menjadi lebih mudah terdeteksi.
i Uji flavonoid
Uji flavonoid pada daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. segar menunjukkan hasil yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan
warna kuning pada lapisan amil alkohol Harborne 1984 pada larutan uji. Intensitas warna kuning tersebut rendah. Hal ini dapat disebabkan oleh sampel
yang berupa daun segar. Sampel tersebut hanya dihaluskan dengan mortar dan tidak diberi perlakuan tertentu sebelum diuji, sehingga senyawa flavonoid belum
terekstrak dengan baik.
j Uji tanin
Uji tanin pada daun cincau hijau segar menunjukkan hasil yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna coklat kehijauan pada
larutan uji. Harborne 1984 menyebutkan bahwa hasil uji tanin adalah adanya pembentukan warna hijau kehitaman pada larutan uji. Warna coklat kehijauan
pada larutan hasil uji dapat dikatakan memiliki intensitas yang lebih rendah jika dibandingkan dengan hasil uji tanin dalam Harborne 1984. Hal ini dapat
disebabkan oleh sampel yang berupa daun segar. Sampel tersebut hanya dihaluskan dengan mortar dan tidak diberi perlakuan tertentu sebelum diuji,
sehingga senyawa tanin belum terekstrak dengan baik.
Bubuk Daun Cincau Hijau P. oblongifolia Merr.
a Uji alkaloid
Uji alkaloid pada bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. menunjukkan hasil yang positif. Hasil tersebut diindikasikan oleh adanya
endapan pada ketiga larutan uji dengan masing-masing jenis pereaksi yang berbeda. Pada larutan uji dengan pereaksi Wagner dihasilkan endapan berwarna
coklat. Pada larutan uji dengan pereaksi Mayer dihasilkan endapan berwarna putih. Pada larutan uji dengan pereaksi Dragendorff dihasilkan endapan merah
jingga. Ketiga hasil uji alkaloid tersebut sesuai dengan Harborne 1984. Warna coklat dan jumlah endapan pada masing-masing pereaksi dengan
sampel bubuk daun ini lebih pekat dibandingkan pada sampel daun segar. Hal ini karena sampel bubuk daun tersebut sudah mengalami perlakuan pendahuluan.
Perlakuan tersebut meliputi penghancuran daun segar dalam media air dengan bantuan blender, kemudian dibiarkan semalam sehingga sebagian menjadi gel,
dikeringkan dengan drum dryer dan dihancurkan kembali dengan blender, sehingga diperoleh bubuk daun cincau hijau dengan ukuran partikel yang
lebih kecil.
Keberadaan senyawa
alkaloid pada
daun cincau
hijau P. oblongifolia Merr. segar menunjukkan bahwa daun cincau hijau memiliki
potensi sebagai bahan antikanker. Hal sesuai dengan pernyataan Kintzios dan Barberaki 2004 serta Meiyanto et al. 2008 bahwa alkaloid merupakan senyawa
yang dapat berperan sebagai antikanker. Perlakuan tersebut memungkinkan senyawa alkaloid dapat terekstrak
dengan baik, sehingga pada uji alkaloid dapat terdeteksi dengan baik.
b Uji steroid
Uji steroid pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini diindikasikan oleh adanya pembentukan warna hijau kecoklatan pada
larutan uji. Hasil uji steroid yang positif, yaitu diindikasikan oleh adanya pembentukan warna hijau-biru Harborne 1984 pada larutan uji.
c Uji saponin
Uji saponin pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang positif. Hal ini sesuai dengan pernyataan Harborne 1984. Hal ini karena uji saponin
menunjukkan adanya pembentukan busa yang stabil selama 30 menit pada permukaan larutan uji, dan jika ditambahkan satu tetes HCl 2 N busa tidak hilang.
Warna coklat busa pada larutan uji dengan sampel bubuk daun ini lebih rendah dibandingkan pada sampel daun segar. Hal ini karena sampel bubuk daun
tersebut sudah mengalami perlakuan pendahuluan yang memungkinkan kerusakan saponin. Wiesman dan Chapagain 2002 menyatakan bahwa saponin adalah
metabolit sekunder tanaman yang berupa molekul glikosilat dengan bobot molekul besar, terdiri atas gula yang berikatan dengan triterpen atau aglikon
steroid.
d Uji fenol hidrokuinon
Uji fenol hidrokuinon pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang positif. Hal ini karena uji fenol hidrokuinon menunjukkan adanya
pembentukan warna hijau gelap setelah ditambahkan FeCl
3
pada larutan uji. Harborne 1984 menyatakan bahwa indikasi positif pada hasil uji fenol
hidrokuinon ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau atau hijau biru
setelah ditambahkan FeCl
3
e Uji Molisch
pada larutan uji. Warna coklat warna hasil uji fenol hidrokuinon yang pekat dapat disebabkan oleh sampel yang berupa bubuk daun.
Kondisi sampel yang telah diberi perlakuan pendahuluan. Perlakuan tersebut memungkinkan senyawa fenol hidrokuinon dapat terekstrak dengan baik,
sehingga pada uji fenol hidrokuinon dapat terdeteksi dengan baik.
Uji Molisch pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang positif. Hal ini sesuai dengan pernyataan Harborne 1984. Hal ini karena uji Molisch
menunjukkan adanya pembentukan warna ungu di antara dua lapisan cairan pada larutan uji. Warna ungu tersebut terbentuk di antara lapisan berwarna merah bata
pada bagian atas dan lapisan transparan di bagian bawah larutan uji. f Uji benedict
Uji benedict berperan untuk mengidentifikasi keberadaan gula pereduksi Harborne 1984. Uji benedict pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil
yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau. Harborne 1984 menyatakan bahwa indikasi positif pada hasil uji benedict
ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau, kuning atau endapan merah bata pada larutan uji.
g Uji biuret
Uji biuret berperan untuk mengidentifikasi keberadaan senyawa peptida Harborne 1984. Uji biuret pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan
hasil yang negatif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau muda pada larutan uji. Harborne 1984 menyatakan bahwa hasil uji biuret yang
positif diindikasikan oleh pembentukan warna ungu. Hasil seperti ini dapat terjadi karena proses pengeringan panas dengan drum dryer sebagai perlakuan
pendahuluan. Proses tersebut menyebabkan denaturasi protein, yaitu pada ikatan peptida yang mengikat antar asam amino, sehingga tidak terdeteksi pada uji biuret
Lehninger 1982. h Uji ninhidrin
Uji ninhidrin pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna kuning pada larutan
uji. Harborne 1984 menyatakan bahwa hasil uji ninhidrin yang positif diindikasikan oleh pembentukan warna ungu.
Hasil uji ninhidrin sesuai dengan hasil uji biuret. Hasil seperti ini dapat terjadi karena proses pengeringan panas dengan drum dryer sebagai perlakuan
pendahuluan. Disamping itu, metode uji ninhidrin menggunakan suhu tinggi. Kedua proses panas tersebut menyebabkan denaturasi protein yang berlebih pada
struktur asam amino Lehninger 1982, sehingga tidak terdeteksi pada uji ninhidrin.
i Uji flavonoid
Uji flavonoid pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna hijau muda pada
larutan uji. Harborne 1984 menyatakan bahwa hasil uji flavonoid yang positif diindikasikan oleh pembentukan warna merah, kuning atau jingga pada lapisan
amil alkohol. Hal ini dapat terjadi karena proses pengeringan panas dengan drum dryer sebagai perlakuan pendahuluan. Proses tersebut menyebabkan kerusakan
senyawa flavonoid, sehingga tidak terdeteksi pada uji flavonoid. Penelitian Raharjo 2004 pada cincau hijau Cylea barbata L.Miers menyatakan bahwa
kandungan flavonoid pada bubuk daun cincau hijau yang relatif rendah disebabkan oleh kerusakan senyawa flavonoid pada saat pembuatan bubuk gel
cincau hijau yang menggunakan drum dryer pada suhu 100°C.
j Uji tanin
Uji tanin pada bubuk daun cincau hijau menunjukkan hasil yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya pembentukan warna coklat kehijauan pada
larutan uji. Harborne 1984 menyebutkan bahwa hasil uji tanin adalah adanya pembentukan warna hijau kehitaman pada larutan uji. Warna coklat kehijauan
pada larutan hasil uji dapat dikatakan memiliki warna coklat yang lebih rendah jika dibandingkan dengan hasil uji tanin dalam Harborne 1984. Hal ini dapat
disebabkan oleh sampel yang berupa bubuk daun. Sampel tersebut telah diberi perlakuan pendahuluan berupa proses pengeringan panas dengan drum dryer.
Proses tersebut dapat menyebabkan kerusakan senyawa tanin, sehingga menunjukkan efektivitas deteksi yang rendah pada hasil uji tanin.
4. 2. Uji Aktivitas Antioksidan Berdasarkan Penangkapan Radikal Bebas DPPH
