6. Pewarnaan IHK imunohistokimia Mekanisme aktivitas antitumor bubuk daun cincau hijau (Premna blongifolia Merr.) pada mencit c3h yang ditransplantasi sel tumor payudara

luas, dalam penelitian biologi serta diagnosis histopatologi dan mikrobiologi. Imunohistokimia sangat aplikatif dengan penggunaan cahaya, fluoresen dan mikroskop elektron. Pereaksi yang digunakan adalah antibodi poliklonal atau monoklonal. Penggunaan pereaksi antibodi dalam aplikasi imunohistokimia harus diujikan pada potongan jaringan. Beberapa hal yang penting untuk diperhatikan dalam analisis dengan metode imunohistokimia adalah spesifitas, akurasi, presisi, sensitivitas dan efisiensi Brandtzaeg et al. 1997. Penambahan warna melalui proses pewarnaan dapat memudahkan dalam pengamatan komponen jaringan dengan mikroskop. Pemilihan warna yang tepat sangat membantu untuk identifikasi jaringan, komponen-komponennya serta diagnosis kondisi patologik. Pengetahuan tentang struktur, reaksi kimia dan pereaksi harus dimiliki dan dipahami dalam pengamatan jaringan Panigoro et al. 2007. Potongan jaringan yang berparaffin tidak dapat menyerap air karena adanya infiltrasi paraffin ke dalam jaringan. Langkah pertama dalam pewarnaan histopatologik adalah pengeluaran paraffin dari potongan jaringan berparaffin deparaffinisasi sehingga jaringan dapat menyerap pereaksi hidrasi Panigoro et al. 2007. Antigen unmasking merupakan salah satu teknik sebagai bagian dari metode pewarnaan IHK. Teknik ini dilakukan karena berawal dari terjadinya penutupan antigen sebagai efek dari fiksasi kimia, pemrosesan dan interaksi media embedding. Pada mulanya, hal ini menjadi suatu masalah serius dalam metode IHK. Selanjutnya, beberapa metode dikembangkan untuk dapat membuka unmasking atau memperoleh kembali antigen seutuhnya sebagai target dalam metode IHK. Teknik pengembalian antigen antigen retrieval techniques atau pembukaan antigen antigen unmasking secara signifikan mampu meningkatkan sensitivitas dalam deteksi epitop dengan metode IHK. Antigen unmasking juga bermanfaat untuk metode lain yang menggunakan sistem deteksi dengan pelabelan histokimia, antara lain flow cyotmetry, hibridisasi in situ, uji TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick labelling serta histokimia asam nukelat D’Amico et al. 2008. Selanjutnya, pemahaman karakteristik warna pada pewarnaan staining histologi sangat diperlukan untuk menghasilkan spesimen histologi yang baik. Langkah penting lain dalam metode imunohistokimia yang termasuk ke dalam bagian pewarnaan staining adalah dehidrasi, penjernihan dan penutupan jaringan pada gelas objek mounting Panigoro et al. 2007, Cell Signaling Technology 2007. Dehidrasi merupakan proses penarikan air dari spesimen histologik yang telah diwarnai. Pada proses dehidrasi, peran air pada jaringan digantikan oleh alkohol dengan beberapa konsentrasi yang diurutkan dari konsentrasi rendah hingga tinggi. Dehidrasi merupakan langkah yang harus dilakukan. Proses dehidrasi dilanjutkan dengan proses penjernihan, yaitu mencelupkan gelas objek ke dalam xylol Panigoro et al. 2007. Spesimen yang telah dijernihkan sangat mudah terdegradasi oleh oksigen dan kelembaban jika dibiarkan terbuka dan menyulitkan dalam pengamatan mikroskop karena debu yang menempel pada spesimen. Spesimen juga dapat mengalami kerusakan yang disebabkan oleh bakteri dan jamur. Kerusakan spesimen dapat dicegah dengan cara menyimpan spesimen secara permanen, yaitu dengan proses penutupan jaringan pada gelas objek mounting Panigoro et al. 2007, Cell Signaling Technology 2007.

3. BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3. 1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret 2009 sampai dengan Oktober 2010. Tempat pelaksanaan penelitian untuk uji fitokimia adalah Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal bebas DPPH adalah Laboratorium Kimia Pangan, SEAFAST Centre, Institut Pertanian Bogor. Pembuatan pakan mencit C3H dilaksanakan di Pilot Plant SEAFAST Centre, Institut Pertanian Bogor. Pengujian aktivitas antitumor dari bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. secara in vivo, pengolahan jaringan tumor mencit C3H dan pewarnaan HE dilakukan di Laboratorium Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Deteksi keberadaan CD31 dan enzim kaspase-3 dari jaringan tumor payudara mencit C3H dengan pewarnaan IHK imunohistokimia dilakukan di Laboratorium Riset Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

3. 2. Bahan

Bahan baku yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman cincau hijau P. oblongifolia Merr.. Peralatan dan perangkat yang dipergunakan dalam penelitian ini terdiri atas peralatan untuk preparasi bahan baku, uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, uji in vivo, pewarnaan HE dan IHK. Bahan-bahan kimia untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH, butylated hydroxytoluene BHT sebagai kontrol positif dan metanol pro analysis sebagai pelarut. Bahan-bahan untuk uji fitokimia adalah akuades, asam sulfat 2 N, pereaksi Mayer, Dragendorff dan Wagner, asam asetat anhidrida, kloroform, asam sulfat pekat, HCl 2 N, etanol 70, FeCl 3 Bahan untuk membuat pakan terdiri dari kasein, minyak jagung sebagai 5, pereaksi molisch, pereaksi benedict, pereaksi biuret dan larutan ninhidrin. sumber lemak, tepung maizena alpha corn starch merk Honing sebagai sumber energi, CMC carboxyl methyl cellulose sebagai sumber selulosa, Bekamin 10 Kimia Farma yang pada tiap tabletnya mengandung vitamin A 1500 SI, tiamin 1 mg, riboflavin 0,5 mg, piridoksin 0,5 mg, niasin 10 mg, vitamin B 5 mg, asam folat 0,5 mg, vitamin B 12 0,5 mg, vitamin C 25 mg, vitamin B 5 dan vitamin D 2 Tabel 3 Komposisi mineral untuk pakan mencit 150 SI. Komposisi mineral diperoleh dari Laboratorium Biokimia Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian IPB dengan komposisi yang disajikan dalam Tabel 3. Peralatan dalam pembuatan pakan meliputi wadah baskom, spatula, kantong plastik, alat pencetak pelet dan drum dryer. Jenis mineral Jumlah dalam 100 g NaCl 139,30 KI 0,79 KH 2 PO 389 4 MgSO 4 .7H 2 57,30 O CaCO 381,40 3 FeSO 4 . 7H 2 27 O MnSO 4 . 7H 2 4,01 O ZnSO 4 . 7H 2 0,55 O CuSO 4 . 5H 2 0,48 O CoCl 2 . 6H 2 0,02 O Bahan untuk pengujian in vivo adalah mencit Mus musculus L C3H, baik donor maupun resipien. Mencit C3H berasal dari Laboratorium Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia. Bahan kimia yang digunakan untuk pengolahan jaringan adalah formalin, larutan Bouin, asam asetat glasial, paraffin, xylol, etanol 70 dan 60, larutan PBS phosphate buffer saline, larutan NaCl fisiologis dan neofren. Peralatan untuk pengolahan jaringan meliputi oven, cetakan antikarat, forsep, lemari pendingin serta gelas objek dan penutupnya. Bahan yang digunakan untuk pewarnaan HE dan IHK adalah jaringan tumor payudara mencit C3H. Bahan khusus untuk pewarnaan HE meliputi pewarna hematoksilin dan eosin. Bahan khusus untuk pewarnaan IHK meliputi antibodi primer anti-CD31 rabbit antimouse dari Biorbyt nomor katalog orb10315, antibodi primer antikaspase-3 rabbit antimouse dari Cell Signaling Technology nomor katalog 9662, antibodi sekunder antirabbit IgG HRP-linked antibody goat antirabbit dari Cell Signaling Technology nomor katalog 7074