sampel dipindahkan ke dalam botol gelas lain untuk penentuan persen kalsium yang terdialisis tersedia dan 10 g untuk penentuan kadar kalsium total dengan
menggunakan Atomic Absorbance Spectrophotometer AAS. Sebanyak 3 g larutan suspensi pepsin 1,6 g pepsin Sigma p-7000
didispersikan ke dalam 0,1 M HCl dan ditepatkan volumenya menjadi 10 ml, dibuat sewaktu akan digunakan, ditambahkan masing-masing ke dalam
botol gelas dan volumenya ditepatkan menjadi 100 ml dengan air. Keduanya kemudian ditutup dengan plastik yang berlubang untuk mengeluarkan gas. Sampel
diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 30
o
C dengan kecepatan 5 120 strokemenit selama dua jam. Selanjutnya botol-botol tersebut disimpan
dalam freezer untuk digunakan pada hari berikutnya. Sebelum digunakan sampel harus dicairkan terlebih dahulu. Sebanyak lima gram campuran pankreatin bile
ditambahkan ke dalam botol gelas yang telah berisi 40 g aliquot yang digunakan untuk penentuan asam tertitrasi. Larutan ini kemudian dititrasi dengan 0,5 NaOH
sampai diperoleh pH 7,5. Nilai pH ini dicek setelah 30 menit. Sebanyak 40 g aliquot sampel dipindahkan ke dalam botol gelas yang
berukuran 250 ml. Selanjutnya NaHCO
3
dengan konsentrasi yang diperoleh dari hasil titrasi dengan NaOH di atas jumlah NaHCO
3
ekuivalen dengan jumlah NaOH yang digunakan untuk titrasi dimasukkan ke dalam kantung dialisis
bersama 25 g air. Botol gelas yang digunakan untuk penentuan persen yang tersedia ditempatkan dalam penangas air yang bergoyang pada suhu 37
o
C dan kecepatan 5 hingga mencair. Kemudian kantung dialisis dimasukkan ke dalam
setiap botol gelas dengan kedudukan sedemikian rupa sehingga kantung dialisis terendam dalam larutan sampel, ditutup dengan plastik yang telah disiapkan.
Inkubasi dilakukan sampai pH 5 selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan 5 g campuran pankreatin bile ke dalam setiap botol gelas tadi dan inkubasi dilanjutkan
selama dua jam. Setelah cukup waktu, kantung dialisis diangkat dan dibilas dengan
mencelupkannya ke dalam air bebas ion. Salah satu ujungnya dipotong dengan menggunakan gunting dan isinya dialisat dituang ke dalam gelas ukur untuk
dihitung volumenya dan dianalisis kandungan kalsium yang tersedia dengan menggunakan AAS.
Perhitungan :
3.3.2.8. Daya cerna protein in vitro
Analisis daya cerna protein in vitro yang digunakan sebagai berikut: sampel ditimbang sebanding dengan 0,2 g protein 0,2 x 100 kadar protein
sampel, kemudian dimasukkan ke dalam tabung fermentor. Ditambahkan 25 ml HCl 0,1 N dengan pH 1,5 yang mengandung pepsin 0,1 g. Kemudian diinkubasi
dalam penangas air bergoyang dengan suhu 37
o
C selama satu jam. Setelah itu, pH dinaikkan menjadi 7,5 dan ditambahkan pankreatin sejumlah 0,1 g dan diinkubasi
pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian disaring dengan pompa vakum menggunakan kertas saring. Setelah itu, dibilas dengan air bersih dan dikeringkan.
Perhitungan: sampel
protein mg
x tercerna
tidak protein
mg sampel
protein mg
protein cerna
Daya 100
− =
3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Model statistika yang digunakan dalam penelitin ini pada tahap kedua adalah metode Rancangan Acak Lengkap Steel dan Torrie, 1989. Perlakuannya
adalah kombinasi tepung ikan pepetek dengan tepung ubi jalar putih dalam pembuatan biskuit B0, B1, B2, B3 dan B4. Analisis data diolah dengan
menggunakan SPSS 11.0. Data diambil sebanyak dua kali ulangan. Adapun model Rancangan Acak Lengkap sebagai berikut :
Y
ij
= µ+ A
i
+ є
ij
Keterangan : Y
ij
: Respon percobaan karena pengaruh faktor A taraf ke-i, ulangan ke-j µ :
Rata-rata umum
A
i
: Pengaruh taraf ke-i, faktor A i = 1,2,3,4 E
ij
: Kesalahan percobaan karena pengaruh faktor A taraf ke-i pada ulangan ke-j
bioavailabilitas Kalsium Ca = mg Ca dialisat x 100 mg Ca sampel
Total Ca tersedia mg100g = Total Ca sampel mg100g x bioavailabilitas
Data peubah yang diamati dianalisis secara statistik dengan analisis ragam ANOVA. Apabila hasil sidik ragam menunjukkan pengaruh yang nyata atau
menunjukan adanya interaksi, maka dilakukan analisis lanjutan yang gunanya untuk mengetahui perlakuan mana yang paling berpengaruh pada percobaan.
Uji lanjut yang digunakan adalah Beda Nyata Jujur BNJ atau Tukey. Data hasil uji organoleptik dianalisis secara statistik non parametrik
Kruskal Wallis . Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah antara perlakuan
berbeda nyata dalam ranking. Apabila hasil analisis menunjukkan hasil yang berbeda nyata, maka dilanjutkan dengan uji lanjut Multiple Comparison yang
bertujuan untuk mengetahui perlakuan mana saja yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap parameter yang dianalisis.
Menurut Steel dan Torrie 1991, perhitungan statistik Kruskal Wallis dilakukan dengan menggunakan rumus :
H =
∑
+ −
+ 1
3 1
12
2
n ni
Ri n
n H` =
Pembagi H
Pembagi = 1 - 1
1 +
−
∑
n n
T
Keterangan : ni = Banyaknya pengamatan dalam perlakuan ke-i
N = Banyaknya data Ri = Jumlah ranking dalam contoh ke-i
T = Banyak pengamatan yang seri dalam ulangan ke-i H` = H terkoreksi
