Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan
353
d = mg sampel protein = N x faktor konsversi
Faktor konversi kadar protein ber- macam bahan pangan
Bahan Faktor
Koreksi Bir, sirop, biji-bijian,
ragi, pakan ternak, buahan teh manisan
anggur, tepung jagung 6.25
Beras 5.95 Roti, gandum,
makaroni, bakmi 5.70
Kacang tanah 5.46
Kedele 5.71 Kenari
5.18 Susu dan produk susu 6.38
16.2.1.2 Metode Biuret Penentuan kadar protein dengan
metode Biuret merupakan salah satu cara terbaik. Dalam larutan,
basa Cu
2+
membentuk kompleks dengan ikatan peptida -CO-NH-
sehingga menghasilkan warna ungu dengan absorbans maksi-
mum pada 540 nm. Absorban berbanding lurus dengan konsen-
trasi protein dan tidak tergantung dari jenis protein karena seluruh
protein memiliki jumlah ikatan peptida yang sama per satuan
berat. Hanya sedikit senyawa lain yang
mengganggu reaksi misalnya urea mengandung gugus –CO-NH-
dan gula pereduksi yang akan bereaksi dengan ion Cu
2+
. Pereaksi yang digunakan dalam
metode Biuret adalah : 1. Pereaksi Biuret
Pereaksi Biuret dibuat dengan melarutkan 3 g CuCO
4
.5H
2
O dan 9 g Na-K-Tartrat dalam
500 ml NaOH 0.2 N Tambahkan 5 g KI, kemudian
encerkan sampai 1000 ml dengan menggunakan NaOH
0.2N
2. Larutan protein standar Buat larutan bovine serum al-
bumin dalam air dengan konsentrasi 5 mgml. Ukur
kadar air serum albumin, nyatakan konsentrasi dengan
dasar berat kering agar lebih tepat.
Peralatan yang digunakan 1. Spektrofotometer
2. Sentrifus 3. Waring
Blender
Cara kerja 1. Pembuatan Kurva Standar
1. Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 blanko, 0.1, 0.2,, 0.4,
0.6, 0.8, dan 1 ml protein standar. Tambahkan air sam-
pai volume total masing- masing 4 ml.
2. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing-
masing tabung reaksi, campur hingga rata.
3. Simpan tabung reaksi pada suhu 37
o
C selama 10 menit atau pada suhu kamar sela-ma
Di unduh dari : Bukupaket.com
Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan
354
30 menit sampai pemben- tukan warna ungu sempurna.
4. Ukur absorbansinya pada 520 nm.
2. Persiapan sampel 1. Sampel harus berupa cairan.
Jika berbentuk padatan maka harus dihancurkan dahulu de-
ngan menggunakan waring blender dan penambahan air.
Hancuran yang diperoleh di- saring lalu disentrifus. Super-
natan di dekantasi untuk di- pergunakan selanjutnya a.
Protein yang terukur pada supernatan adalah soluble
protein . Perhatikan faktor pe-
ngenceran. 2. Jika cairan berupa larutan
protein seperti protein kon- sentrat, isolat yang tidak keruh,
maka persiapan sam-pel cukup dengan pengen-ceran
secukupnya saja. Jika cirannya keruh atau me-
ngandung bahan-bahan yang mengganggu seperti glukosa,
maka harus dilakukan per- lakuan berikut :
- Aliquot ekstrak didistri-
busikan ke dalam tabung reaksi seperti pada pene-
tapan standar, kemudian tambahkan air sampai vo-
lume total masing-masing 1 ml.
- Kedalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 1
ml trichloroacetic acid TCA 10 sehingga
protein akan terdenaturasi
- Setrifus pada 300 rpm selama 10 menit sampai
protein yang terdenaturasi mengendap. Supernatan
dibuang dengan cara de- kantasi.
- Kedalam endapan tambah- kan 2 ml etil eter, campur
merata lalu sentrifus kem- bali untuk menghilangkan
residu TCA. Biarkan me- ngering pada suhu kamar.
- Kedalam endapan kering ditambahkan 4 ml air.
Campur hingga merata jangan harapkan seluruh-
nya akan larut. - Tambahkan 6 ml pereaksi
Biuret, alkali dalam pere- aksi ini akan melarutkan
nedapan yang tersisa.
3. Penetapan sampel 0.1 – 1 ml sampel dipipet tepat
dimasukkan kedalam tabung re- aksi, kemudian diperlakukan
seperti menetapkan standar. 16.2.1.3 Metode Lowry
Metode Lowry menghasilkan penghitungan protein lebih sensitif
dibandingkan metode Biuret.
Prinsip dari penetapan protein dengan metode lowry dilakukan
berdasarkan terbentuk-nya warna biru yang dihasilkan dari reaksi
antara Cu
2+
dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat
dan asam fosfo-tungstat oleh tirosin dan triptofan merupakan
residu protein.
Di unduh dari : Bukupaket.com
Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan
355
Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat
dan fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tergantung
pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein.
Senyawa fenolik juga dapat membentuk warna biru, sehingga
akan mengganggu penghitungan. Untuk menghilangkannya lakukan
pengendapan protein dengan TCA, hilangkan supernatan. La-
rutkan kembali protein yang diendapkan oleh TCA, baru
dianalisis. Pereaksi yang digunakan dalam
metode Lowry adalah : 1. Natrium karbonat 2 dalam
larutan NaOH 0.1N 2. Tembaga sulfat 0.5 dalam
larutan NaK tartrat 1 dibuat hanya pada waktu akan
digunakan. 3. Campuran 50 ml pereaksi 1
dengan 1 ml pereaksi 2 hanya pada waktu akan
digunakan, hanya stabil sela- ma 1 hari
4. Pereaksi Folin Ciocalteau pe- reaksi fenol
Pereaksi ini biasanya tersedia secara komersil, larutkan
dengan air 1 : 1 sebelum digunakan. Pereaksi ini dapat
dibuat sendiri dengan cara sebagai berikut :
Masukkan 100 g natrium tungstat, 25 g natrium
molibdat, 500 ml akuades, 50 ml asam fosfat 85 dan
100 ml HCl pekat ke dalam labu 2 liter.
Campuran direfuks secara hati-hati selama 10 jam
dengan menggunakan kondensor. Sesudah di-
dinginkan, tambahkan ke dalam labu 150 g litium
sulfat, 50 ml akuades dan beberapa tetes Br
2
Brom. Pendidihan dilanjutkan la-
gi selama 10 menit de- ngan tanpa kondenser,
untuk menghilangkan ke- lebihan Brom.
Setelah didinginkan, vo- lume larutan dijadikan 100
ml dan saring jika perlu. Filtrat tidak boleh ada
warna kehijauan. Bila ada maka perlu dilakukan pen-
didihan sekali lagi. Ini merupakan ’reagent stok’.
Larutkan dengan air 1 : 1 sebelum digunakan.
5. Larutan protein standar 0.25 mgml larutan bivine serum
albumin
Cara Kerja : 1. Pembuatan Kurva Standar
a. Masukkan ke dalam tabung
reaksi : 0 blanko, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml
protein standar. Tambah air sampai volume total masing-
masing 4 ml. Kedalam masing-masing tabung reaksi
tambahkan 5.5 ml pereaksi 3, campur merata dan biarkan
selama 10 – 15 menit pada suhu kamar.
Di unduh dari : Bukupaket.com
Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan
356
b. Tambahkan 0.5 ml pereaksi 4 ke dalam masing-masing
tabung reaksi, kocok merata dengan cepat setelah
penambahan.
c. Biarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk.
d. Ukur absorbansinya pada 650 nm
e. Buat kurva standar. 2. Persiapan sampel
Lakukan seperti mempersiap- kan sampel penetapan pro-tein
metode biuret.
3. Penetapan sampel
0.1 – 1 ml sampel dipipet tepat, masukkan kedalam ta-
bung reaksi kemudian diperla- kukan seperti penetapan
standar.
16.2.1.4 Metode Dye Binding Metode dye binding hanya dapat