Metode Biuret Penentuan kadar protein dengan

Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan 353 d = mg sampel protein = N x faktor konsversi Faktor konversi kadar protein ber- macam bahan pangan Bahan Faktor Koreksi Bir, sirop, biji-bijian, ragi, pakan ternak, buahan teh manisan anggur, tepung jagung 6.25 Beras 5.95 Roti, gandum, makaroni, bakmi 5.70 Kacang tanah 5.46 Kedele 5.71 Kenari 5.18 Susu dan produk susu 6.38

16.2.1.2 Metode Biuret Penentuan kadar protein dengan

metode Biuret merupakan salah satu cara terbaik. Dalam larutan, basa Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida -CO-NH- sehingga menghasilkan warna ungu dengan absorbans maksi- mum pada 540 nm. Absorban berbanding lurus dengan konsen- trasi protein dan tidak tergantung dari jenis protein karena seluruh protein memiliki jumlah ikatan peptida yang sama per satuan berat. Hanya sedikit senyawa lain yang mengganggu reaksi misalnya urea mengandung gugus –CO-NH- dan gula pereduksi yang akan bereaksi dengan ion Cu 2+ . Pereaksi yang digunakan dalam metode Biuret adalah : 1. Pereaksi Biuret Pereaksi Biuret dibuat dengan melarutkan 3 g CuCO 4 .5H 2 O dan 9 g Na-K-Tartrat dalam 500 ml NaOH 0.2 N Tambahkan 5 g KI, kemudian encerkan sampai 1000 ml dengan menggunakan NaOH 0.2N 2. Larutan protein standar Buat larutan bovine serum al- bumin dalam air dengan konsentrasi 5 mgml. Ukur kadar air serum albumin, nyatakan konsentrasi dengan dasar berat kering agar lebih tepat. Peralatan yang digunakan 1. Spektrofotometer 2. Sentrifus 3. Waring Blender Cara kerja 1. Pembuatan Kurva Standar 1. Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 blanko, 0.1, 0.2,, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml protein standar. Tambahkan air sam- pai volume total masing- masing 4 ml. 2. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing- masing tabung reaksi, campur hingga rata. 3. Simpan tabung reaksi pada suhu 37 o C selama 10 menit atau pada suhu kamar sela-ma Di unduh dari : Bukupaket.com Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan 354 30 menit sampai pemben- tukan warna ungu sempurna. 4. Ukur absorbansinya pada 520 nm.

2. Persiapan sampel 1. Sampel harus berupa cairan.

Jika berbentuk padatan maka harus dihancurkan dahulu de- ngan menggunakan waring blender dan penambahan air. Hancuran yang diperoleh di- saring lalu disentrifus. Super- natan di dekantasi untuk di- pergunakan selanjutnya a. Protein yang terukur pada supernatan adalah soluble protein . Perhatikan faktor pe- ngenceran. 2. Jika cairan berupa larutan protein seperti protein kon- sentrat, isolat yang tidak keruh, maka persiapan sam-pel cukup dengan pengen-ceran secukupnya saja. Jika cirannya keruh atau me- ngandung bahan-bahan yang mengganggu seperti glukosa, maka harus dilakukan per- lakuan berikut : - Aliquot ekstrak didistri- busikan ke dalam tabung reaksi seperti pada pene- tapan standar, kemudian tambahkan air sampai vo- lume total masing-masing 1 ml. - Kedalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 1 ml trichloroacetic acid TCA 10 sehingga protein akan terdenaturasi - Setrifus pada 300 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap. Supernatan dibuang dengan cara de- kantasi. - Kedalam endapan tambah- kan 2 ml etil eter, campur merata lalu sentrifus kem- bali untuk menghilangkan residu TCA. Biarkan me- ngering pada suhu kamar. - Kedalam endapan kering ditambahkan 4 ml air. Campur hingga merata jangan harapkan seluruh- nya akan larut. - Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret, alkali dalam pere- aksi ini akan melarutkan nedapan yang tersisa.

3. Penetapan sampel 0.1 – 1 ml sampel dipipet tepat

dimasukkan kedalam tabung re- aksi, kemudian diperlakukan seperti menetapkan standar. 16.2.1.3 Metode Lowry Metode Lowry menghasilkan penghitungan protein lebih sensitif dibandingkan metode Biuret. Prinsip dari penetapan protein dengan metode lowry dilakukan berdasarkan terbentuk-nya warna biru yang dihasilkan dari reaksi antara Cu 2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfo-tungstat oleh tirosin dan triptofan merupakan residu protein. Di unduh dari : Bukupaket.com Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan 355 Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Senyawa fenolik juga dapat membentuk warna biru, sehingga akan mengganggu penghitungan. Untuk menghilangkannya lakukan pengendapan protein dengan TCA, hilangkan supernatan. La- rutkan kembali protein yang diendapkan oleh TCA, baru dianalisis. Pereaksi yang digunakan dalam metode Lowry adalah : 1. Natrium karbonat 2 dalam larutan NaOH 0.1N 2. Tembaga sulfat 0.5 dalam larutan NaK tartrat 1 dibuat hanya pada waktu akan digunakan. 3. Campuran 50 ml pereaksi 1 dengan 1 ml pereaksi 2 hanya pada waktu akan digunakan, hanya stabil sela- ma 1 hari 4. Pereaksi Folin Ciocalteau pe- reaksi fenol Pereaksi ini biasanya tersedia secara komersil, larutkan dengan air 1 : 1 sebelum digunakan. Pereaksi ini dapat dibuat sendiri dengan cara sebagai berikut : ƒ Masukkan 100 g natrium tungstat, 25 g natrium molibdat, 500 ml akuades, 50 ml asam fosfat 85 dan 100 ml HCl pekat ke dalam labu 2 liter. ƒ Campuran direfuks secara hati-hati selama 10 jam dengan menggunakan kondensor. Sesudah di- dinginkan, tambahkan ke dalam labu 150 g litium sulfat, 50 ml akuades dan beberapa tetes Br 2 Brom. ƒ Pendidihan dilanjutkan la- gi selama 10 menit de- ngan tanpa kondenser, untuk menghilangkan ke- lebihan Brom. ƒ Setelah didinginkan, vo- lume larutan dijadikan 100 ml dan saring jika perlu. ƒ Filtrat tidak boleh ada warna kehijauan. Bila ada maka perlu dilakukan pen- didihan sekali lagi. Ini merupakan ’reagent stok’. Larutkan dengan air 1 : 1 sebelum digunakan. 5. Larutan protein standar 0.25 mgml larutan bivine serum albumin Cara Kerja : 1. Pembuatan Kurva Standar a. Masukkan ke dalam tabung reaksi : 0 blanko, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml protein standar. Tambah air sampai volume total masing- masing 4 ml. Kedalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 5.5 ml pereaksi 3, campur merata dan biarkan selama 10 – 15 menit pada suhu kamar. Di unduh dari : Bukupaket.com Pengawasan Mutu Bahan Produk Pangan 356 b. Tambahkan 0.5 ml pereaksi 4 ke dalam masing-masing tabung reaksi, kocok merata dengan cepat setelah penambahan. c. Biarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. d. Ukur absorbansinya pada 650 nm e. Buat kurva standar. 2. Persiapan sampel Lakukan seperti mempersiap- kan sampel penetapan pro-tein metode biuret.

3. Penetapan sampel

0.1 – 1 ml sampel dipipet tepat, masukkan kedalam ta- bung reaksi kemudian diperla- kukan seperti penetapan standar.

16.2.1.4 Metode Dye Binding Metode dye binding hanya dapat