Karakter biokimiawi Pertumbuhan S treptococcus sp dalam medium garam empedu

Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 530 Prinsipnya adalah bahwa asam laktat diisolasi dari sampel bebas protein protein diendapkan dengan TCA 20 oleh senyawa CuSO 4 dan CaOH 2. Asam laktat tersebut kemudian dipanaskan dengan H 2S O 4 pekat untuk diubah menjadi asetal dehida. Selanjutnya asetal dehid dapat dibaca densitasnya pada spektrofotometer dengan 560 nm. Absorbansinya diketahui dan kadar asam laktatnya dapat dihitung bedasarkan persamaan standar asam laktat yang telah di analisis terlebih dahulu. Tahap isolasi asam laktat, dengan cara memasukkan 1 ml sampel ke dalam tabung sentrifuge kemudian tambahkan TCA 10 hingga volume 5 ml. Sentrifuge pada kecepatan 2750 rpm selama 15 menit. Mengambil 1 ml supernatan yang sudah diencerkan 20 kali yaitu 1 ml supernatan dalam 19 ml aquadesh, lalu tambahkan 0,5 ml CuSO 4 20 dan 0,5 g CaOH 2 serta aquadesh hingga volume totalnya 5 ml. Menutup rapat campuran tersebut dan homogenkan selama 30 menit kemudian sentrifuge pada 2750 rpm selama 15 menit. Membuat blanko yaitu mengganti supernatan dengan aquadesh Tahap penentuan kadar asam kaktat pada sampel , dengan cara memindahkan 0,5 ml supernatan ke dalam tabung reaksi lalu tambahkan 0,025 ml CuSO 4 4 dan 3 ml H 2 SO 4 pekat segera masukkan tabung ke dalam air mendidih selama 5 menit. Mendinginkan larutan tersebut dalam es suhu 20°C, setelah dingin segera teteskan 0,05 ml reagen parahidroksibifenil. Inkubasi dalam suhu kamar selama 30 menit lalu panaskan lagi dalam air mendidih selama 90 detik, kemudian dinginkan dalam suhu kamar. Membaca absorbansi dalam spektrofotometer dengan 560 nm. Analisis Data Isolasi dan seleksi serta karakteristik isolat terseleksi dianalisis secara deskriptif. Pola kinetika fermentasi, dan pada uji ketahanan terhadap garam empedu dianalisis variansi Anova dan apabila signifikan kemudian dilanjutkan dengan uji DMRT. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Penelitian Dalam penelitian ini dilakukan isolasi, karakterisasi dan identifikasi bakteri asam laktat dari limbah kotoran ayam Broiler strain Lohman. Dari ke-15 isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dilakukan pengamatan morfologi koloni pada agar plate yang menyangkut warna, bentuk, elevasi, tepi dan Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 531 struktur dalam koloni. Sebagian besar koloni bakteri asam laktat berwarna putih susuputih dan berbentuk sirkuler. Tepi koloni sebagian besar berbentuk entire dan struktur dalamnya berupa opaque. Isolasi merupakan suatu proses untuk mendapatkan suatu jenis bakteri dari berbagai sumber. Isolasi disini lebih difokuskan pada bakteri asam lakat. Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai bakteri yang mempunyai kemampuan tinggi dalam memproduksi asam laktat dari berbagai sumber karbohidrat yang dapat difermentasi. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat Ke-15 isolat bakteri asam laktat yang telah berhasil diisolasi dilakukan karakterisasi lebih lanjut yang menyangkut morfologi sel, karakter biokimiawi dan karakter fisiologis. Kelompok karakter morfologi sel meliputi beberapa karakter yaitu bentuk sel, susunan sel, dan reaksi gramgram staining dan motilitas. Kelompok karakter biokimiawi meliputi unit karakter yaitu uji katalase, tipe fermentasi. Hampir 90 isolat bakteri asam laktat memiliki bentuk sel coccus atau bulat, sisanya berbentuk bacil atau batang, dengan susunan sel rantai atau pasangan, tetrad dan soliter. isolat bakteri asam laktat menunjukkan reaksi positif terhadap uji gram staining, tetapi bereaksi negatif dan positif terhadap uji motilitas non-motil. Hasil penelitian yang menyangkut karakter biokimiawi dari isolat bakteri asam laktat menunjukkan bahwa ke-15 isolat bakteri asam laktat bersifat katalase negatif dan tipe fermentasi homofermentatif ada 9 isolat, AST 01, AST 04, AST 06, AST 07,AST 09, AST 11, AST 13, dan AST 14. Isolat bakteri asam laktat mampu membentuk asam dari berbagai jenis sumber karbon, tetapi tidak disertai dengan pembentukan gas, seperti yang telah disajikan pada tabel 1. Tabel 1. Pengujian karakter bentuk sel serta karakter biokimia berupa uji katalase dan pengecetan gram No Kode isolat Tipe karakter Bentuk sel Sifat gram Katalase 1 AST 001 Coccus Coccus + + - - 2 AST 002 Basil Basil - - - - 3 AST 003 Basil Basil + + - - Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 532 4 AST 004 Basil Basil + + - - 5 AST 005 Coccus Coccus - - - - 6 AST 006 Coccus Coccus - - - - 7 AST 007 Coccus Coccus + + - - 8 AST 008 Coccus Coccus + + - - 9 AST 009 Coccus Coccus + + - - 10 AST 010 Coccus Coccus + + - - 11 AST 011 Coccus Coccus - - - - 12 AST 012 Basil Basil + + - - 13 AST 013 Coccus Coccus - - - - 14 AST 014 Basil Basil - - - - 15 AST 015 Coccus Coccus + + - - Karakteristik mikroskopis dilakukan untuk mengetahui karakteristik morfologi sel. Pengamatan morfologi sel dilakukan hingga perbesaran kuat 1000X yang diperjelas dengan meneteskan minyak imersi pada gelas benda. Karakterisasi morfologi sel meliputi bentuk sel, susunan sel, gram staining dan motilitas. Dari uji fermentasi glukosa maka didapatkan bahwa semua isolat dapat menghasilkan asam. Akan tetapi, semua isolat bakteri tidak menghasilkan gas, sehingga dapat digolongkan dalam bakteri asam laktat homofermentatif, yang berarti bahwa produk utama fermentasinya hanya berupa asam laktat Axelsson, 2004: 20. Tahap karakterisasi biokimiawi dengan melakukan serangkaian pengujian yaitu uji katalase, tipe fermentasi, uji pembentukan asam dan gas dari berbagai jenis sumber karbon. Tabel 2 Pengujian biokimia dan pengamatan fisiologi isolat bakteri asam laktat umur 24 jam. No. Kode Motilitas Produksi gas Tipe fermentasi 1 AST 001 Non mtl - Homofer Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 533 2 AST 002 Non mtl - Homofer 3 AST 003 Non mtl + Heterofer 4 AST 004 Non mtl - Homofer 5 AST 005 Non mtl + Heterofer 6 AST 006 Non mtl - Homofer 7 AST 007 Non mtl - Homofer 8 AST 008 Non mtl + Heterofer 9 AST 009 Non mtl - Homofer 10 AST 010 Non mtl - Homofer 11 AST 011 Non mtl - Homofer 12 AST 012 Non mtl - Homofer 13 AST 013 Non mtl - Homofer 14 AST 014 Non mtl + Heterofer 15 AST 015 Non mtl - Homofer Keterangan: Fk. anae : Homofer : homofermentatif: Heterofer : heterofermentatif Hasil karakterisasi makroskopis belum dapat digunakan sebagai acuan untuk menentukan masing-masing genus karena adanya kesamaan karakter yang dimiliki oleh tiap isolat, baik karakter koloni pada lempeng agar dan agar miring. Oleh karena itu perlu adanya karakterisasi lebih lanjut berupa karakterisasi secara mikroskopis untuk mengetahui morfologi sel dari masing-masing isolat bakteri asam laktat. Sebelum pengamatan sel dilakukan, masing-masing isolat bakteri asam laktat diwarnai dengan pengecatan gram untuk melihat sifat dinding sel dan bentuk sel. Pengecatan gram membedakan dua kelompok bakteri, yaitu bakteri gram positif dan negatif. Dari hasil pengamatan , terlihat bahwa isolat bakteri asam laktat berwarna ungu dan merah, sehingga dapat dikelompokkan ke dalam bakteri gram positif dan negatif. Hampir sebagian besar isolat memiliki bentuk sel coccus atau bulat, sedikit yang Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 534 berbentuk bacil atau batang. Isolat bakteri asam laktat menunjukkan susunan sel rantai, berpasangan, soliter dan tetrad, dan memiliki sifat non motil. Data hasil pengamatan Tabel 2, menunjukkan semua isolat bakteri menunjukkan reaksi negatif, terhadap uji katalase yang ditunjukkan dengan tidak munculnya gelembung. Pengujian tipe fermentasi digunakan untuk menggolongkan bakteri asam laktat ke dalam kelompok homofermentatif dan heterofermentatif. Untuk menentukan tipe fermentasi, dilakukan uji produksi gas, yaitu dengan menumbuhkan kultur pada 10 ml MRS cair selama 2-3 hari dengan tabung durham diletakkan secara terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan. Menurut Borck et al., 1994 dalam Soetanto 2004 perbedaan antara bakteri asam laktat homofermentatif dengan bakteri heterofermentatif selain dari produk yang dihasilkan adalah tidak adanya enzim aldolase yang merupakan salah satu enzim kunci dalam glikolisis. Bakteri heterofermentatif tidak memiliki enzim aldolase sehingga tidak dapat memecah fruktosa bifosfat menjadi triosa bifosfat. Bakteri heterofermentatif mengoksidasi glukosa 6-fosfat menjadi pentose fosfat dan akhirnya direduksi menjadi triosa fosfat yang dibantu oleh enzim phosfoketolase. Identifikasi bakteri Asam Laktat Identifikasi yaitu suatu proses untuk menentukanmenduga golongan atau kelompok suatu bakteri hasil isolasi dari berbagai sumber berdasarkan karakter fenotipik dari bakteri. Identifikasi untuk menduga kemungkinan genus dan spesies bakteri dilakukan dengan cara Profile Matching, melalui penelusuran pada Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology Holt et al., 1994 berdasarkan hasil karakterisasi fenotipik. Isolat bakteri yang terseleksi menunjukkan sifat-sifat sebagai bakteri asam laktat dengan karakter penciri gram positif, non motil, non endospora dan katalase negatif Axelsson, 2004. Karakter bentuk dan susunan sel menjadi karakter pembeda ke tingkat genus. Setelah diketahui genusnya maka dilanjutkan identifikasi lanjut untuk menduga kemungkinan spesies dari isolat bakteri. Berdasarkan karakter bentuk dan susunan sel bakteri serta sejumlah karakter fenotipik yang telah ditelusuri lewat Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology Holt et al., 1994 dari ke-15 isolat bakteri asam laktat memiliki kecenderungan Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 535 karakter yang mengarah pada 4 kelompok genus bakteri asam aktat yaitu Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus dan Enterococcus. Genus Lactobacillus Isolat AST 03, AST 04, dan AST 12 mempunyai bentuk sel bacil atau batang, sehingga cenderung masuk dalam anggota genus Lactobacillus. Anggota genus ini memiliki karakter yang relatif hampir sama, yaitu katalase negatif, gram positif, bentuk sel basil, ukuran 0,5 –1,2 x 1,0-10,0 µm, homofermentatif, non motil, susunan selnya soliter berpasangan berantai, warna koloni putihputih susu, tepi koloni entire, bentuk koloni bulat, struktur dalam opaque, pertumbuhan pada agar miring lebatabundant dan memiliki bentuk beaded. Tumbuh pada suhu 45 o C serta mampu membentuk asam dari berbagai sumber karbon, diantaranya adalah galaktosa, laktosa, maltosa, sukrosa, glukosa, fruktosa dan sorbitol. Berdasarkan hasil identifikasi dengan metode Profile Matching yang mengacu pada Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology, semua ciri-ciri fenotipik diatas cenderung mengarahkan anggota genus Lactobacillus paling dekat masuk menjadi anggota spesies Lactobacillus acidophilus. Akan tetapi untuk keabsahannya diperlukan karakter-karakter kunci yang dapat dilihat dalam Bergey‟s Manual of Systematic Bacteriology untuk menetapkan isolat bakteri asam laktat sampai level spesies. Genus Pediococcus Genus Pediococcus meliputi Isolat AST 01, AST 07, AST 08 dan AST 15 dengan pengecatan gram menunjukkan gram positif, katalase negatif, bentuk sel kokus, homofermentatif, non motil, susunan selnya tetradberpasangan dengan diameter 05-2.0 µm, warna koloni putih susuputih, tepi koloni entire, bentuk koloni bulat, struktur dalam opaque, pertumbuhan pada agar miring sedangmoderat dan memiliki bentuk beadedfilliform . Untuk menduga kemungkinan spesies isolat bakteri asam laktat, dilakukan dengan metode Profile Matching yang ditelusuri lewat Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology . Genus Enterococcus Enterococcus meliputi isolat AST 06, AST 11, dan AST 13 memiliki karakter gram negatif, katalase negatif, bentuk sel coccus, ukuran 0,6-2,0 x 0,6-2,5 µm, susunan selnya berpasangan atau rantai, tipe fermentasi homofermentasi, non motil, produksi gas Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 536 negatif tidak ada, warna koloni putih susu, bentuk koloni bulat, tepi koloni entire, struktur dalam opaque, pertumbuhan pada agar miring tipisslight dan memiliki bentuk effusespreadingfilliform . Genus Streptococcus Identifikasi pada genus Streptococcus dengan anggota isolat AST 09, dan AST 10 yang telah dilakukan memiliki ciri gram positif, bentuk sel coccus dengan diameter 0,5-2,0 µm, susunan selnya rantaipasangan, uji katalase negatif, non motil, homofermentasi, warna koloni putih susu, bentuk koloni bulat, tepian entire, dan struktur dalamnya opaque, pertumbuhan pada agar miring sedang moderattipis slight dan memiliki bentuk filliform.

1. Penetapan Kadar Asam Laktat Masing-Masing Isolat Bakteri

Setelah serangkaian uji yang dilakukan terhadap masing-masing isolat, pengujian selanjutnya adalah pengujian untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri asam laktat dalam menghasilkan asam laktat. Asam laktat merupakan produksenyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat selama melakukan proses fermentasi karbohidrat. Semakin tinggi asam laktat yang dihasilkan akan semakin baiksemakin unggul dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat yang kemampuan menghasilkan asam laktatnya rendah. Pengukuran kadar asam laktat tersebut dilakukan pada kultur murni isolat yang berumur 24 jam. Berdasarkan hasil perhitungan diketahui bahwa isolat AST 04 memiliki kadar asam laktat tertinggi sebesar 57,68 . Dengan kadar asam laktat yang cukup tinggi maka bakteri tersebut dapat dimanfaatkan sebagai probiotik, hal ini disebabkan karena asam laktat yang dihasilkan mampu mencegah pertumbuhan bakteri patogen. Asam-asam organik seperti asam laktat dan asam asetat yang diproduksi bakteri asam laktat sebagai hasil fementasi laktosa dapat membantu aktivitas kecernaan dan penyerapan. Isolat-isolat yang telah diamati dan diuji baik uji morfologi, biokimiawi dan fisiologis, serta memiliki sifat atau ciri bakteri asam laktat, kemudian diukur kadar asam laktatnya pada saat isolat bakteri berumur 24 jam. Kadar asam laktat tertinggi dihasilkan oleh AST 04 yaitu sebesar 57,68 , sedangkan asam laktat terendah dihasilkan oleh AST 05 yaitu sebesar 9,41 . Hasil pengukuran kadar asam laktat tiap isolat disajikan dalam tabel 3 Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 537 Tabel 3. Kadar laktat pada masing-masing isolat bakteri asam laktat umur 24 jam. No. Kode Nilai Absorbansi Kadar laktat 1 AST 001 0,225 22,25 2 AST 002 0,401 40,49 3 AST 003 0,319 31,99 4 AST 004 0,567 57,69 5 AST 005 0,101 9,41 6 AST 006 0,176 17,17 7 AST 007 0,392 39,56 8 AST 008 0.432 43,71 9 AST 009 0,247 24,53 10 AST 010 0,290 28,99 11 AST 011 0,317 31,78 12 AST 012 0,301 30,13 13 AST 013 0,125 11,89 14 AST 014 0,281 28,05 15 AST 015 0,198 19,45 Di lain pihak asam laktat yang diproduksi oleh bakteri asam laktat selama proses fermentasi dapat menambah cita rasa dan aroma pada makanan dan pada waktu yang sama pertumbuhan bakteri yang merugikan dapat dicegah karena bakteri asam laktat melakukan kompetisi dengan mikroba patogen atau organisme yang tidak diinginkan Calo-Mata et al., 2008. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : 1. Pada limbah kotoran ayam Broiler Strain Lohman umur 34 hari ditemukan 15 isolat bakteri asam laktat. 2. Isolat bakteri asam laktat memiliki karakterciri seperti gram positif, katalase negatif, non motil, bentuk sel batangcoccus, susunan sel rantai, berpasangan,