Prosedur Uji Aktivitas anti plasmodial in-vitro

Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi 2 Uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro Uji aktivitas antiplasmodium in vitro dilakukan dengan 2 metode yaitu metode mikroskopis menurut Ljungström et al. 2004. Ke dalam mikrokultur 96 sumuran yang mengandung kultur Plasmodium pada fase tropozoit dengan parasitemia 2 hematokrit 3, ditambahkan senyawa uji pada berbagai peringkat konsentrasi. Kultur yang mengandung senyawa uji selanjutnya diinkubasikan selama 72 jam. Nilai parasitemia dihitung dari sediaan apus yang diwarnai dengan Giemsa. Nilai parasitemia ini selanjutnya digunakan untuk menghitung persentase penghambatan pertumbuhan Plasmodium. Sebagai kontrol digunakan kultur Plasmodium tanpa senyawa uji dan dianggap mempunyai pertumbuhan 100. Aktivitas antiplasmodium dinyatakan sebagai IC 50 Inhibitury Concentration 50 yaitu konsentrasi yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan parasit hingga 50 yang dihitung dengan analisis probit. Cara 2. Plasmodium falciparum strain FCR-3 dan D10 dibiakkan dengan metoda candle jar Trager dan Jensen,1976. Sel darah merah yang terinfeksi parasit dibiakkan dalam cultur flask yang mengandung 10 mL medium komplit mengandung 10 serum, dengan hematokrit akhir 1,5. Kultur parasit tesebut dilaksanakan di dalam laminary flow cabinet dalam kondisi steril, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO 2 pada temperatur 37 C. Medium diganti dengan yang baru setiap 24 jam masa inkubasi. Apabila parasitemia terlalu tinggi lebih dari 10, maka dibuat subkultur dengan menambahkan sel darah merah normal sehingga parasitemia menjadi rendah kurang dari 1. 2. Uji toksisitas in vitro Uji sitotoksik fraksi aktif dilakukan pada kultur sel fibroblas dengan cara yang prinsipnya sama dengan uji antiplasmodial in vitro. Sel dibiakkan dengan kondisi yang sama dengan kondisi biakan P. falciparum, dengan mengganti serum manusia dengan serum fetal bovin . Untuk keperluan uji sitotoksik kultur sel sebanyak 100 l didistribusikan dalam mikrokultur 96 sumuran 2 x 10 3 untuk setiap sumuran. Selanjutnya ditambahkan 100 l senyawa uji pada berbagai konsentrasi 0; 1; 5; 10; 50; 100 dan 500 gml secara triplikat. Kultur sel yang mengandung senyawa uji selanjutnya diinkubasikan selama 24 dan 72 jam. Pertumbuhan sel diperkirakan berdasarkan pengambilan [ 3 H] senyawa uji oleh sel. Sebagai Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi kontrol digunakan kultur sel tanpa senyawa uji dan dianggap memiliki pertumbuhan 100. Efek sitotoksik dinyatakan sebagai IC 50 kadar untuk menghambat pertumbuhan sel hingga 50. Tingkat sitotoksisitas fraksi uji dinyatakan sebagai Indeks Sitotoksik IS yang merupakan rasio aktivitas antiplasmodial in vitro IC 50 pada parasit dan efek sitotoksik IC 50 pada sel normal. Sebagai kontrol tingkat sitotoksisitas digunakan IS dari klorokuin.

3. Uji aktivitas anti plasmodial in-vivo pada mencit

Metode : Modifikasi dari Peter test ―4 days suppressive Test‖, treatmen dilakukan pada 3 kelompok uji dengan dosis 100,10 dan 1 mgkg BB mencit dan 1 kelompok kontrol negatif, masing masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit. Bahan uji diberikan secara peroral dalam bentuk suspense dengan CMC-Na 0,5. Treatmen dilakukan selama 4 hari D0-D3. Pada hari pertama treatmen D0 dan satu hari setelah treatmen berakhi D4 diambil darah dari ekor dan dibuat hapusan darah tipis dengan pewarnaan Giemsa untuk menghitung tingkat parasitemia. Kemudian data dihitung sebagai penghambatan pertumbuhan parasit pada kelompok treatmen dibandingkan kelompok control negatif tanpa obat

C. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro

Hasil pengembangan diuji aktivitas antimalaria secara in-vitro. Pengujian aktivitas antiplasmodium in vitro terhadap turunan xanton menggunakan metoda visual atau metoda mikroskopik yang dilakukan pada masa inkubasi selama 72 jam. Uji aktivitas dilakukan terhadap P.falciparum strain PCR -3 resisten klorokuin dan strain D -10 sensitif klorokuin. Aktivitas anti plasmodium dievaluasi dengan menentukan aktivitas penghambatan pertumbuhan parasit setelah ditambah senyawa uji dengan berbagai konsentrasi pada mikrokultur P.falciparum.

a. Persentase parasitemia dan penghambatan antiplasmodium.

Langkah pertama dari uji aktivitas antiplasmodium adalah kultur secara berkelanjutan terhadap kedua strain P.falciparum dengan metode candle jar Trager dan Jensen, 1876. Setelah kultur tumbuh secara baik dan tidak terkontaminasi, kemudian dilakukan uji aktivitas Seminar Nasional Hasil-hasil Penelitian Teknologi, MIPA dan Pendidikan Vokasi antiplasmodium. Besarnya aktivitas penghambatan dari tiap kadar senyawa uji diketahui dengan menghitung persen penghambatan yang diberikan oleh turunan xanton terhadap pertumbuhan P.falciparum yaitu dengan cara menghitung selisih persen parasitemia kontrol negatif dengan persen parasitemia senyawa bahan uji, selanjutnya dibandingkan dengan persen parasitemia kontrol negatif. Tabel 1: Persen penghambatan turunan xanton senyawa terhadap strain FCR -3 P.falciparum pada masa inkubasi 72 jam. Seny awa Dosis Penghambatan Pertumbuhan parasit Rerata IC50±SDμM 1 A 11 Cairan pekat 13,74 14,17 17,71 15,21 ± 2,18 2 Am 7 kristal 385,02 320,11 282,00 329,04 ± 52,09 3 A 5 kristal 400 400 400 400 4 A 2 kristal 53,25 52,51 73,11 59,62 ± 11,69 5 A 1 kristal 10 10 10 10 6 A 7 kristal 10 10 10 10 7 Am 10E 58,47 69,81 83,83 70,70 8 A 13 cairan pekat 35,13 34,55 36,08 35,25± 0,77 9 A 14 cairan pekat 47,66 49,39 46,93 47,99±1,26 10 A 12 cairan pekat 202,87 161,57 209,26 191,23±25,89 11 Am 5C cairan pekat 440,67 733,54 512,47 562,23±152,64 12 Am 3B cairan pekat 400 400 400 400 13 Am 1A 87,09 66,57 77,49 77,05 ±10,27 14 Am 2A 12,43 19,67 19,54 17,21±4,14 15 Am 4B 246,31 312,44 273,60 277,60±33,23 16 Am 6C cairan pekat 7,024 7,52 8,39 7,64±0.69 17 Am 6D 400 400 400 400 18 Am 8D 78,57 74,57 88,79 80,64±7,33 19 Am 9E 73,91 68,60 81,26 81,26±6,36