126 127
Kerusakan hati telah teramati secara histopatologi disertai dengan peningkatan kadar aldehid dehidrogenase sebagai biomarker awal kerusakan setelah konsumsi alkohol secara berulang [8; 9].
Marker 8OHdG ini dapat didegradasi lewat urin dan analisisnya dengan HPLC-ECD, elektroforesis kapiler, dan GC [10; 11; 12; 13]. Untuk pengembangan pemeriksaan biomarker
etanol dan mengetahui kerusakan oksidatif DNA yaitu 8OHdG telah dilakukan penelitian optimasi dengan pereaksi dansil klorida dan analisisnya dengan TLC-Spektrofotodensitometri.
2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan ”True experimental optimized instrumentation method” and applicated the urine samples after ethanol consumption.
3. Metode Penelitian Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, sentrifuge, Solid Phase Extraction SPE, GC-MS, TLC-Spektrofotodensitometri, alat-alat gelas yang telah disterilisasi,
pipet khusus untuk pemberian alkohol, wadah penampungan urin. Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tikus Wistar sebanyak 20 ekor,
etanol, es batu, dansil klorida, 8-hidroksi-2-deoksiguanosin 8-OHdG dari Sigma, metanol,
KH
2
PO
4
, pH 7, Etil asetat, metanol, dan amonia serta semua reagen berderajat pro analisis.
Tempat Penelitian
Penelitian ini dikerjakan di Laboratorium Kimia Universitas Udayana dan analisis 8OHdG dengan GC-MS dan TLC Spektrofotodensitometri di Laboratorium Forensik POLRI cabang Denpasar.
Perlakuan etanol pada tikus Wistar
Dua puluh ekor tikus Wistar dipelihara dan diadaptasikan selama satu bulan dengan standar perawatan hewan percobaan diberikan makan standar dan minum air. Larutan etanol 20 dan pereaksi-pereaksi
kimia untuk penenlitian ini dibuat di jurusan kimia F.MIPA UNUD. Tikus Wistar diambil secara random dibagi menjadi 2 kelompok, masing-masing kelompok sebanyak 10 ekor. Po adalah kontrol,
P1 adalah perlakuan alkohol 20 selama 6 minggu. Tikus sebelum perlakuan dipuasakan selama 2 jam dengan tujuan agar analisis tidak terganggu oleh zat atau obat lain selain alkohol. Kemudian
tikus kontrol diberikan 1,0 mL akuades, tikus perlakuan diberikan 1,0 mL alkohol 20 secara adlibitum dengan jarum steril di kandang percobaan hewan Universitas Udayana. Penampungan
sampel urin dilakukan sehari setelah pemberian etanol terakhir setelah 6 minggu ditempatkan pada wadah steril dan diisi es batu segera disimpan pada suhu -20
o
C sebelum dianalisis. Masing-masing sampel disentrifuge 2000 g selama 10 menit kemudian endapan dipindahkan sebelum dibersihkan
dengan SPE.
Preparasi sampel urin dengan SPE
Kolom SPE di kalibrasi dengan 10 mL metanol, 10 mL air, dan 10 mL 5 mM KH
2
PO
4
, pH 7 buffer A. Sebanyak 5 mL urin ditambahkan 2,5 mL 8-OHdG dan dicampur sebelumnya dengan 2,5 mL
HCl 2M. Kolom dicuci dengan 3 mL buffer A dan 8OHdG dan dielusi dengan 3 mL metanol 15 dalam buffer A. Eluat kemudian dicampur dengan 6 mL CH
3
CN dan disentrifuge 2000g selama 5 menit. Eluat diuapkan sampai kering di bawah vakum pada 39-40
o
C, residu dilarutkan dengan 0,5 mL metanol [10].
Analisis 8OHdG dengan GC-MS
8OHdG standar dan dalam sampel urin hasil clean up dengan SPE diderivatisasi dengan campuran 50 µL BSTFA dan CH
3
CN 2:1,vv, kemudian dipanaskan selama 30 menit pada 100
o
C. Selanjutnya ditambahkan 250 µg kafein sebagai stándar internal kemudian dilakukan analisis dengan GC-MS
Gambar 3.1 pada kondisi dan sitem optimum. Pemilihan sistem dan kondisi GC-MS sampai diperoleh pemisahan yang baik yang ditunjukkan dengan nilai resolusi atau daya pisah antara 2
komponen 1,5.
Analisis 8OHdG dengan TLC-Spektrofotodensitometri
8OHdG standar dan dalam sampel urin hasil clean up dengan SPE diderivatisasi dengan pereaksi dansil klorida dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya dilakukan elusi dengan fase gerak sistem TE
yaitu campuran etil asetat : metanol : 25 amonia = 17:2:1 dan analisis 8OHdG dengan TLC- spektrofotodensitometri yang ditunjukkan dalam Gambar 3.2.
Gambar 3.1 GC-MS Gambar 3.2 TLC Spektrofotodensitometri
4. Hasil Dan Pembahasan
