60 61
satu ose pada 5 ml media cair MRS broth, diinkubasi 37
O
C selama 24 jam. Biakan diukur serapan optiknya 0,1 λ 660 nm dengan jumlah bakteri 1 x 10
9
sel ml [11]. Biakan diambil 1 ml untuk dicampur dan diratakan diatas permukaan media Nutrien Agar, dibiarkan kurang lebih 10 menit
sampai inokulum kering untuk selanjutnya dibuat sumuran dengan “gel puncher ” yang berdiameter
kurang lebih 5 mm. Sumur diisi dengan 15 µl substansi ekstraseluler dan dieramkan pada suhu 37
O
C selama 24 jam. Sebagai kontrol negatif digunakan akuades steril dan antibiotic disk Ampicillin 10
µg sebagai kontrol positif. Zona terang yang terbentuk disekeliling sumuran menunjukkan adanya antivitas antimikroba terhadap bakteri penguji dan diameter zona yang terbentuk diukur dengan alat
jangka sorong.
Penentuan Waktu Optimum Aktivitas Antimikroba
Penentuan waktu optimum aktivitas antimikroba dilakukan dengan cara yang sama seperti pada pengujian aktivitas antimikroba dengan beberapa bakteri penguji seperti diatas, hanya saja
aktivitasnya diamati setiap jam jam 1 sampai 12 serta setiap hari hari 1 sampai 10.
3. Hasil Dan Pembahasan Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Waktu Generasi
Hasil pengukuran serapan optik terhadap selang waktu inkubasi sehingga diperoleh kurva pertumbuhan untuk isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 seperti pada Gambar 1.
0.01 0.06
0.11 0.16
0.21 0.26
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11
Waktu Pertumbuhan Jam ke-
O D
660 n m
A B
C D
Keterangan : A= Fase lag, B=Fase logaritmik, C=Fase stasioner, dan D=Fase kematian Gambar 1. Pola pertumbuhan isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 pada media MRS broth
Data pada Gambar 1 menunjukkan bahwa isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 memiliki fase lag sekitar 1 jam, dilanjutkan dengan fase logaritmik mulai jam ke-2 sampai jam
ke 5, fase stasioner mulai jam ke-5 sampai jam ke-6, untuk selanjutnya memasuki fase kematian mulai jam ke 6 sampai jam ke-11. Berpedoman atas pola pertumbuhan isolat
Gambar 1 di atas, maka dapat digunakan untuk menentukan waktu generasi atau waktu yang dibutuhkan oleh isolat untuk membelah menjadi dua sel baru, yang didasarkan
atas perhitungan fase logaritmiknya. Hasil perhitungan waktu generasi dari isolat seperti Tabel 1.
Tabel 1. Perhitungan waktu generasi isolat Lactococcus lactis spp lactis 1. Isolat
Umur biakan Jam
Nilai OD λ 660 nm
Waktu generasi jam
Rata-rata jam
Lactococcus lactis spp lactis
1 2
0.056 -
2,25 3
0.081 1.892
4 0.097
3.871 5
0.195 1.000
Tabel 1 menunjukkan bahwa untuk isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 memiliki waktu generasi 2,25 jam. Waktu generasi yang diperoleh ternyata lebih lama dari penelitian yang dilakukan oleh
Bintang [12]. Dari hasil penelitiannya diketahui bahwa waktu generasi untuk Streptococcus lactis BCC 2259 yang ditanam pada media Lemco tripton cair adalah 1,668 jam, disamping juga masih
lebih lama dari penelitian Suarsana sebesar 0,77 jam [10]. Penentuan pola pertumbuhan dan waktu generasi dari isolat sangat penting dilakukan karena terkait erat dengan waktu optimum
dihasilkannya substansi antimikrobial. Sintesis bakteriosin substansi antimikroba oleh bakteri
terjadi selama fase pertumbuhan logaritmik eksponensial, sedangkan substansi antibiotik akan dihasilkan pada fase stasioner [13, 14].
Produksi dan Pengujian Aktivitas Senyawa Antimikroba
Senyawa antimikroba berupa substansi ekstraseluler sebagai hasil sentifugasi selanjutnya disesuaikan pH nya menjadi pH 7,0 disamping juga diendapkan dengan garam ammonium sulfat
untuk selanjutnya diuji aktivitasnya dengan metode sumur. Hasil penelitian aktivitas antimikroba dari isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 seperti tersaji pada Gambar 2.
Keterangan : 1 = Cairan ekstraseluler 2 = Cairan ekstraseluler pH 7
3.= Cairan ekstraseluler diendapkan dengan ammonium sulfat pH 7 4.= Kontrol negatif
K= Kontrol positif antibiotic disk Ampicillin 10 µg
62 63
Gambar 2. Diameter zona hambat substansi ekstraseluler dari isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 dengan bakteri indikator Staphylococcus aureus ATCC 29213
Hasil pengukuran selengkapnya diameter zona hambat dari isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 terhadap berbagai jenis bakteri indikator seperti tersaji pada Tabel 2
Tabel 2. Hasil pengukuran diameter zona hambat substansi ekstraseluler dari isolate Lactococcus lactis spp lactis 1 terhadap berbagai jenis bakteri indicator
Substansi Diameter zona hambat mm
Staphylococcus aureus ATCC 29213
Bacillus cereus ATCC 11778
Escherichia coli ATCC 25922
1 9,2
7,1 5,5
2 6,1
5,0 6,2
3 6,1
5,5 8,9
4 K
15,0 14,1
11,5 Keterangan : 1 = Cairan ekstraseluler
2 = Cairan ekstraseluler pH 7 3.= Cairan ekstraseluler diendapkan dengan ammonium sulfat pH 7
4.= Kontrol negatif K= Kontrol positif antibiotic disk Ampicillin 10 µg
Memperhatikan data pada Tabel 2 di atas, maka dapat diteguhkan bahwa isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 memiliki aktivitas antibakteri yang luas broad spectrum yakni dapat menghambat
bakteri indikator Gram positif maupun Gram negatif. Kemampuan substansi ekstraseluler bakteriosin didalam menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun Gram negatif
juga pernah dilaporkan oleh beberapa peneliti diantaranya seperti Lyon dan Glatz [15] yang melaporkan bahwa bakteriosin PLG-1 yang dihasilkan oleh Propionibacterium thoenii selain
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif juga mampu menghambat bakteri Gram negatif seperti E.coli JM 109, E.coli V517, Campylobacter jejuni,
P. luorescen, P. aeruginosa dan Vibrio parahaemolyticus.
Hasil yang sama juga pernah dilaporkan oleh Suarsana [10] yang menemukan bahwa bakteriosin hasil isolasi Lactococcus plantarum asal susu sapi mastitis, juga mempunyai
aktivitas brood spectrum yang dicirikan oleh kemampuannya untuk menghambat pertumbuhan bakteri E.coli disamping bakteri lainnya seperti Micrococcus varians, Staphylococcus epidermidis
dan Staphylococcus aureus.
Penentuan Waktu Optimum Produksi Senyawa Antimikroba
Pengamatan terhadap waktu optimum produksi senyawa antimikroba dilakukan dengan melakukan pengamatan secara beruntun terhadap daya hambat yang dihasilkan oleh substansi ekstraseluler
dari isolat yaitu terhadap biakan umur 1-12 jam, serta umur 1–10 hari. Hasil pengamatan terhadap diameter zona hambat yang terbentuk seperti Gambar 3.
Gambar 3. Diameter zona hambat substansi ekstraseluler dari isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 dengan bakteri indikator Staphylococcus aureus ATCC 29213 yang diamati setiap jam
A dan setiap hari B. Hasil pengamatan terhadap aktivitas antimikroba berupa diameter zona hambat yang dibentuk
oleh substansi ekstraseluler telah diendapkan dengan garam ammonium sulfat pH 7,0 pada Gambar 3, menunjukkan bahwa substansi ekstraseluler tersebut belum dihasilkan dalam hari
pertama, namun mulai dihasilkan pada hari ke -2 dan puncaknya pada hari ke-6. Apabila dilihat dari pola pertumbuhan isolat Lactococcus lactis spp lactis 1 seperti Gambar 1, maka mulai jam
ke-2 sampai jam ke-5, bakteri telah memasuki fase pertumbuhan logaritmik dimana produksi substansi ekstraseluler mencapai tahap optimum dan antara jam ke-5 sampai ke-6 telah memasuki
fase pertumbuhan eksponensial yang menandakan kemampuan produksi dari bakteri telah mencapai tahap statis. Fenomena hasil penelitian yang didapat, sejalan dengan pendapat dari peneliti Stoffels
et al., [13].dan Sameles et al., [14]. Disamping faktor fase pertumbuhan, biosintesis substansi
ekstraseluler bekteriosin juga dipengaruhi oleh faktor media, pH, suhu, waktu inkubasi dan aerasi [16].
Waktu inkubasi yang lebih dari 6 hari ternyata menunjukkan aktivitas antimikroba dari substansi ekstraseluler bakteriosin mulai menurun. Penyebab menurunnya aktivitas antimikroba pada
inkubasi yang terlalu lama telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Dajani dan Wannamaker [17] menyatakan bahwa penyebab hilangnya aktivitas antimikroba adalah karena timbulnya inaktivator
antimikroba yang spesiik atau karena adanya sifat reabsorpsi antimikroba oleh sel produsen. Peneliti lainnya, Yang et al., [18] juga menyatakan bahwa antimikrobial peptide bakteriosin yang
dihasilkan BAL dapat terabsorpsi kembali oleh produsen. Dalam proses ini pH merupakan faktor krusial yang sangat menentukan derajat absorpsi dari peptida ini. Secara umum diperkirakan 93-
100 molekul bakteriosin akan diabsorpsi kembali pada pH mendekati 6 dan kurang lebih 5 diabsorpsi pada pH 1,5 – 2. Lebih lanjut Parente et al., [19] melaporkan bahwa penurunan pH media
selama inkubasi akan menyebabkan bakteriosin diabsorpsi oleh permukaan sel produsen dan juga inaktivasi bakteriosin oleh enzim proteolitik.
64 65
4. Simpulan
