Hasil dan Pembahasan Indikasi Radiologi intervensi

54 55 melaporkankan bahwa metode PCR mempunyai sensitiitas 10 takizoit 10 5 sel leukosit [1] . Deteksi T gondii dengan metode PCR pada cairan amnion dapat memberi angka sensitivitas 97,4 dan spesiisitas 99,7 Hohlfeld et al.,1994 [1] . Primer gen B1 pada metode PCR dapat mendeteksi 10 takizoit, metode ini lebih akurat dibanding dengan uji bioassay. Peneliti yang menggunakan gen B1 sebagai primer memberikan hasil yang sangat sensitif untuk mendeteksi T.gondii di jaringan maupun cairan amnion Owen et al.,1998; Susanto et al.,2002 dan Priyowidodo, 2003 [1,6] . Dibandingkan dengan capture ELISA dan immunobloting, deteksi T. gondii pada mencit menggunakan metode PCR paling sensitif, yaitu 18 jam setelah infeksi sudah dapat dideteksi Haid et al., 2001 [1] . Tujuan penelitian untuk mendeteksi T. gondii pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras secara molekuler dengan metode PCR.

2. Bahan dan Metode

Bahan penelitian yaitu organ jantung, hati, otak yang berasal dari mencit yang telah diinfeksi dengan inokulat jantung dan otak ayam buras. Mencit yang mengalami peningkatan titer serum dari preinokulasi, 2 minggu I inokulasi sampai 2 minggu II inokulasi. Sepuluh mencit yang dipilih yaitu: mencit yang diinokulasi dengan organ ayam buras berasal dari Badung DJ.I.2 dan DJ.II.1, Denpasar DJ.I.1, Tabanan DO.I.2 dan DO.II.1, Buleleng DJ.II.1, Gianyar DO.II.1, Klungkung DJ.I.2 dan DJ.II.1, Bangli DJ.II.1 dan darah mencit yang positif terinfeksi T. gondii. Primer yang digunakan adalah primer Sag-1 yaitu: Forward: 5 ′ -CACCTGTAGGAAGCTGTAGTCACT-3 ′ Reverse: 5 ′ -TCACTGTGACCATACAACTCTGTG - 3 ′ Isolasi DNA dilakukan dengan cara yaitu sekitar 50 mg organ mencit dicacah dengan scalpel. Dimasukkan kedalam tabung ependorf 1,5 ml. Jaringan yang telah tercacah dihomogenkan dengan menggunakan pastel. Selanjutnya jaringan yang telah homogen, DNA nya diisolasi sesuai prosedur “pure-link genomic isolation kit ” Invitrogen. Hasil isolasi DNA ini disimpan pada -20 C sampai digunakan. Metode PCR komponen utama yang diperlukan adalah DNA cetakan; oligonukleotida primer yaitu sekuen oligonukleotida pendek 15–25 bp yang untuk mengawali sintesis rantai DNA; deoksiribonukleotida trifosfat dNTP terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP; enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA dan senyawa buffer yang mengandung MgCl2 Purwanto et al ., 1997; Yuwono, 2006; Sudjadi, 2008 [2,4] . Polymerase Chain Reaction dilakukan dengan R-reaction mix 2xPCR Invitrogen yang telah mengandung 0,2 mM dNTP, 1,6 mM MgSO4 dan buffer. Formulasi PCR pada penelitian ini diatur sebagai berikut : tabung ependorf mini ke dalamnya dimasukkan sebanyak 1 µl DNA 5µgµl yang telah diisolasi dari jantung dan otak ayam kampung dan ditambahkan primer forward 1 pmol 0,6µl dan reverse 1 pmol 0,6µl, ditambahkan R-mix 10xbuffer dan 0,2 mM dNTP 5 µl. Setelah penambahan enzim Taq polymerase 1 unit 0,25 µl dan terakhir ditambahkan aquabidest sehingga volume akhir menjadi 10 µl, tabung PCR dimasukkan ke dalam Thermocycler eppendorf mastercycler personal atau PTC-100 TM . Mesin penyiklus panas diprogram sesuai metode PCR Yuwono 2006 dan Sudjadi 2008 dengan kondisi 95 C selama 1 menit denaturasi, kemudian diturunkan 94 C selama 45 detik, selanjutnya pengaturan suhu annealing diatur sesuai hasil optimasi pengaturan suhu annealing primer yang digunakan [2] . Untuk primer Sag-1 digunakan suhu annealing 55 C. Elongasi dengan suhu 72 C selama 1 menit. Siklus dengan kondisi ini diulang 35 kali. Pada bagian akhir diinkubasi pada suhu 72 C selama 5 menit sampai selesai mencapai 22 C. Langkah selanjutnya dilakukan elektroforesis pada gel agarose 1 yang telah diisi ethidium bromide dengan konsentrasi 25 µgml dengan tegangan 100 Volt selama 30 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan ultraviolet UV dan didokumentasi dengan kamera digital.

3. Hasil dan Pembahasan

Hasil isolasi DNA organ mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras diperoleh kualitas DNA seperti tersaji pada gambar 1. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA Toxoplasma gondii dari organ mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras. Keterangan: M. Marker 1200 bp, 1.DNA Tbn.DO.II.1, 2.DNA Klk.DJ.II.1, 3.DNA Dps.DJ.I.1., 4.DNA Bdg.DJ.II.1., 5.DNA Gyr.DO.II.1., 6. DNA Bgl.DJ.II.1., 7. DNA Bll.DJ.II.1., 8. DNA darah mencit terinfeksi T. gondii, 9. DNA Bdg.DJ.I.2., 10. DNA Klk.DJ.I.1., 11. DNA Tbn.DO.I.2 Analisis kualitas DNA hasil isolasi berasal dari organ mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras seperti tersaji pada Gambar 1, dapat dijelaskan bahwa DNA terlihat fragmennya pendek. Deoxyribonucleic acid Gyr.DO.II.1., Bgl.DJ.II.1., Bll.DJ.II.1., DNA darah mencit terinfeksi T. gondii dan DNA Klk.DJ.I.1 tidak terlihat pita DNA. Kemungkinan DNA tersebut mempunyai panjang basa yang rendah dibawah 100 bp sehingga tidak nampak pita pada elektroforesis. Hasil ampliikasi DNA berasal dari mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras dengan primer sag-1, seperti tersaji pada Gambar 2. Gambar 2. Hasil ampliikasi DNA Toxolasma gondii dengan primer sag-1 pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras. Keterangan: M. Marker 1200 bp, 1.DNA Tbn.DO.II.1, 2.DNA Klk.DJ.II.1, 3.DNA Dps.DJ.I.1., 4.DNA Bdg.DJ.II.1., 5.DNA Gyr.DO.II.1., 6. DNA Bgl.DJ.II.1., 7. DNA Bll.DJ.II.1., 8. DNA darah mencit terinfeksi T. gondii, 9. DNA Bdg.DJ.I.2., 10. DNA Klk.DJ.I.1., 11. DNA Tbn.DO.I.2., 12. DNA takizoit T. gondii kontrol positif, 13. Kontrol negatif. 56 57 Hasil ampliikasi DNA T. gondii pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras tidak terlihat pita DNA dari hasil elektroforesis. Hasil ini mengindikasikan bahwa DNA T. gondii berasal dari mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras dengan primer sag-1 tidak berhasil diampliikasi menggunakan metode PCR. Hasil elektroforesis dari produk PCR ternyata tidak muncul pita DNA Gambar 2, hal ini kemungkinan karena DNA yang diampliikasi kuantitasnya terlalu rendah tidak mencukupi untuk ampliikasi secara PCR atau kemurnian DNA yang kurang sehingga terganggu oleh kehadiran protein atau fenol yang dapat mengganggu PCR. Kemurnian DNA 1,5 – 1,8 masih memenuhi standar murni Sambrook and Russell, 2001, demikian pula konsentrasi minimal 1 µgµl DNA template diperlukan untuk PCR Brown, 2006 [2] . Sampel organ untuk isolasi DNA berasal dari mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras dan sudah ditera titer serumnya. Mencit yang dipilih untuk sampel deteksi molekuler T. gondii adalah yang mengalami peningkatan titer serum dari preinokulasi, 2 minggu I inokulasi dan 2 minggu II inokulasi, hal ini dimaksudkan untuk memastikan bahwa terjadi respon antibodi IgG yang terus meningkat selama infeksi. Sesuai pendapat Jacobs et al.1960 bahwa hewan dengan titer antibodi 1:2048, pada ototnya kemungkinan mengandung T. gondii sehingga dapat diproses untuk ekstraksi sistanya [1] . Pada penelitian ini organ yang dipilih untuk pemeriksaan molekuler dengan PCR berasal dari mencit yang mempunyai titer serum 512 – 1024 EU. Hasil ini mengindikasikan bahwa titer serum pada mencit 1024 EU tidak disertai dengan kehadiran sista T. gondii pada organnya, sehingga tidak dapat dideteksi secara molekuler.

4. Kesimpulan dan Saran